WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 22 |

5 9 3 минаева любовь валерьевна ^/-/emaci^cl^ эксперртментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения цржлофо

-- [ Страница 10 ] --

Для осуществления реакции ех tempore из фармакопейного препарата «Пергидроль» готовили 0,3 % раствор Н2О2 на 0,1 М калий-фосфатном бу­ фере с рН 7,4. Полученный раствор имел экстинцию Е=0,700 на длине волны 260 нм против дистиллированной воды в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Цитозольную фракцию печени и почек дополнительно разводили 0,1 М калий-фосфатным буфером с рН 7,4 в соотношении - 1:49, для мозга использовали исходную фракцию. Гемолизат эритроцитов дополнительно разводили 5 мМ трис-НС1 буфером с рН 7,4 в соотношении 1:19. Фермента­ тивную реакцию проводили при комнатной температуре. К 2,5 мл 0,3 % рас­ твора перекиси водорода добавляли 100 мкл разведенной (как указано выше) цитозольной фракции или гемолизата. Через 5 мин реакцию останавливали внесением 0,2 мл 20 % раствора трихлоруксусной кислоты. В контрольные пробы цитозоль или гемолизат вносили после кислоты. Затем опытные и контрольные пробы центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин.

Супернатант фотометрировали на спектрофотометре DU 650 против дистил­ лированной воды на длине волны 260 нм в кювете с длиной оптического пу­ ти 10 мм. Активность каталазы рассчитывали по разнице содержания Н2О2 в опытных и контрольных пробах в соответствии с законом Бугера-ЛамбертаБэра с учетом молярного коэффициента светопоглощения на длине волны 260 нм, 8=22 М'^см"'. Активность выражали в мкмоль/(минт белка) или мкмоль/(минт гемоглобина) (для эритроцитов).

2.5.8. Определение концентрации диеновых конъюгат Определение концентрации ДК в гомогенатах тканей и гемолизате эритроцитов осуществляли по методике И.Д.Стальной [68] в модификации Глушкова С.И.[18]. Принцип метода основан на экстракции ДК из иссле­ дуемого материала и измерении их концентрации по характерному спектру поглощения с максимумом при длине волны 233 нм.

К 0,5 мл гомогената тканей печени, почек, головного мозга или 0,5 мл гемолизата эритроцитов, разведенного 5 мМ ТРИС-НС1 буфером с рН 7,6 в соотношении - 1:19, добавляли 4,5 мл экстрагирующей смеси гептан:изопропиловый спирт, приготовленной в соотношении 1:1 по объему. Пробирки плотно закрывали полиэтиленовыми пробками и тщательно перемешивали активным встряхиванием в течение 5 мин, после чего давали отстояться (до образования четкой границы между фазами), отбирали 0,5 мл гептановой (верхней) фазы и добавляли к ней 2,5 мл этилового спирта (96°). Оптическую плотность раствора определяли в кювете с длиной оптического пути 10 мм против этилового спирта с гептаном (соотношение 5:1) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 233 нм. Концентрацию ДК рассчитывали с учетом разведения с использованием молярного коэффициента светопоглощения на указанной длине волны (Е=2,2 10^ М ' с м ^) и выражали в нмоль/г ткани (для гомогенатов тканей) или в нмоль/г гемоглобина (для гемолизата эритроци­ тов).

2.5.9. Определение концентрации малонового диальдегида Концентрацию МДА определяли по методу M.Uchiyama [155] в моди­ фикации Глушкова С.И.[18]. Принцип метода основан на взаимодействии между МДА и тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в кислой среде при высокой температуре с образованием окрашенного триметинового комплекса, имею­ щего максимум поглощения на 532 нм.

К 0,3 мл гомогената тканей печени, почек, головного мозга или 0,3 мл гемолизата эритроцитов, разведенного 5 мМ ТРИС-НС1 буфером с рН 7,6 в соотношении - 1:19, добавляли 3 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты и 1 мл 0,6% раствора ТБК ("Sigma ", США). При этом рН смеси находился в интервале от 1,6 до 1,8, что представляло оптимальную зону для проведения ТБК-реакции с гомогенатами тканей. Закрытые крышками пробирки инку­ бировали на кипящей водяной бане в течение 45 мин. После охлаждения проводили экстракцию ТБК-продуктов добавлением 3 мл н-бутанола. Бутанольные экстракты фотометрировали на спектрофотометре DU 650 в кювете с длиной оптического пути 10 мм на двух длинах волн (532 и 580 нм) против н-бутанола. Концентрацию ТБК-продуктов рассчитывали согласно методике В.Б.Гаврилова (1987) по разнице оптических плотностей Е535-580 с з^етом разведения и коэффициента пересчета К=1,88Т0 М" см" и выражали в нмоль/г ткани (для гомогенатов тканей) и нмоль/г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Содержание белка определяли методом Лоури в модификации G.L.Peterson [143].

Принцип метода заключается в осуществлении двух последовательных реакций, специфических для определения белка: с тартратом-карбонатом меди, взаимодействующим в щелочной среде с пептидной связью, и реаген­ том Фолина-Чикольте, взаимодействующим с ароматическими аминокисло­ тами. В результате происходит образование окрашенных комплексов, имеющих максимум светопоглощения на длине волны 750 нм, при этом ин­ тенсивность окраски пропорциональна содержанию белка в пробе.

К 0,99 мл дистиллированной воды добавляли 10 мкл цитозольной фракции печени, почек или мозга, а затем 0,1 мл 0,15 % раствора дезоксихолата натрия («Sigma», США). Пробы инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, затем белок в пробах осаждали 0,1 мл 72 % раствора трихлоруксусной кислоты. Далее пробы центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об./мин. Супернатант удаляли, к осадку добавляли 1 мл воды и мл реагента, приготовленного из равных объемов 10 % раствора додецилсульфата натрия, 0,8 М раствора NaOH, дистиллированной воды и раствора тартрата-карбоната меди (0,1% сульфат меди, 0,2% тартрат калия-натрия и 10% карбонат натрия). После добавления к осадку реагента происходило растворение осадка. Полученный раствор инкубировали при температуре +30°С в течение 10 мин. Затем в раствор вносили 0,5 мл 0,33 М реагента Фолина-Чикольте («Serva», Германия) и после встряхивания пробы оставляли в темном месте на 30 мин. Затем пробы фотометрировали на спектрофотометре DU 650 против дистиллированной воды на длине волны 750 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Для определения содержания белка строили калибровочную кривую, для чего готовили водные растворы бычьего сывороточного альбумина с концентрацией от 0, до 10,0 г/л, из них отбирали пробы для определения содержания белка по описанной методике и получали значения экстинкции, соответствующие конкретным концентрациям. По калибровочной кривой рассчитывали со­ держание белка в цитозольной фракции и выражали в г/л.

2.5.11. Определение концентрации гемоглобина Содержание гемоглобина в гемолизатах эритроцитов определяли с по­ мощью стандартных наборов "Ольвекс" (Россия) гемиглобинцианидным ме­ тодом.

Принцип метода заключается в окислении гемоглобина в присутствии железосинеродистого калия до метгемоглобина, образующего с ацетонциангидрином окрашенный гемиглобинцианид, имеющий максимум светопоглощения на длине волны 540 нм.

К 2,5 мл трансформирующего реагента, содержащего 0,1 % двуугле­ кислый натрий, 0,02 % железосинеродистый калий и 0,047 % ацетонциангидрин, добавляли 50 мкл гемолизата эритроцитов. После перемещивания пробы фотометрировали на спектрофотометре DU 650 («Весктап»,США) на длине волны 540 нм против трансформирующего раствора в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Расчет концентрации гемоглобина прово­ дили с учетом экстинкции стандартного раствора гемиглобинцианида, со­ ответствующего определению содержания гемоглобина по указанному ме­ тоду в гемолизате с содержанием гемоглобина 60 г/л. Концентрацию вы­ ражали в г/л..

2.6. Определение маркеров гепато- и нефротоксичности в сыворотке 2.6.1. Определение биохимических показателей токсичности в сыво­ ротке крови экспериментальных животных Биохимические показатели токсичности [158] (аланинаминотрансферазу, аспартатаминотрансферазу, креатинин, общий билирубин) в сыворот­ ке крови экспериментальных животных при повторном введении ЦФ опре­ деляли на автоматическом биохимическом анализаторе Synchron Beckman culter («Beckman», США), щелочную фосфатазу и мочевину на автоматиче­ ском биохимическом анализаторе Hitachi -902 Automatik analyzer («Hitachi», Япония).

2.7.Гистологическое исследование тканей печени и почек экспери­ Гистологическое исследование тканей печени и почек отравленных и контрольных животных проводили после их фиксации 10% нейтральным формалином и окрашивания гематоксилином и эозином.

2.8.Статистическая обработка результатов Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6,0». В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Проводился корреляционный анализ изменений показате­ лей системы глутатиона в эритроцитах и ткани печени отравленных живот­ ных. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оце­ нивали по t-критерию Стьюдента. Приведенные в тексте и таблицах значе­ ния представляли в виде Хер + Шх

ОБМЕН ГЛУТАТИОНА И ПРОЦЕССЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ

ЛИПИДОВ В ТКАНЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ

ПОВТОРНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ЦИКЛОФОСФАНОМ

Данные, приведенные в обзоре литературы, показывают, что системе глутатиона принадлежит важная роль в поддержании клеточного гомеостаза, а нарушения состояния этой биохимической системы и ряда ее регуляторных функций могут играть важную роль в реализации цитотоксических эффектов действия ряда ксенобиотиков.

Так, в основе цитотоксического воздействия ЦФ лежит повреждение молекулярных структур клетки (нуклеиновых кислот, ферментов, липидов биомембран) реакционно-способными метаболитами ЦФ и активными фор­ мами кислорода, образующимися в результате микросомального окисления токсиканта. Система глутатиона принимает непосредственное участие в детоксикации ЦФ путем конъюгации его метаболитов [70], в защите клетки от повреждающего действия свободных радикалов [43,45], а также участвует в процессах репарации поврежденных макромолекул.

Однако, исследования роли системы глутатиона в формировании ци­ тотоксического эффекта при длительной интоксикации ЦФ малыми дозами являются неполными и требуют более детального изучения.

Цель данного исследования - это комплексное изучение функциональ­ ного состояния системы глутатиона и процессов перекисного окисления ли­ пидов (концентрации восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, диеновых конъюгатов и малонового диальдегида, активность глутатионредуктазы, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, глутатионпероксидазы, глутатион-8-трансферазы и каталазы) в тканях головного мозга, печени, по­ чек и эритроцитах лабораторных животных при повторном введении циклофосфана.

Изучение динамики изменений концентрации восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, диеновых конъюгатов и малонового диальдегида, активности глутатионредуктазы, глюкозо-6фосфатдегидрогеназы, глутатионпероксидазы, глутатион-8-трансферазы и каталазы в тканях проводилось при повторной интоксикации ЦФ в дозах и 40 мг/кг. Определение указанных биохимических показателей проводили на 1, 3, 5, 7 и 10 сутки после введения токсиканта в одной из используемых доз. Для сравнения изменений, происходящих в тканях на каждом из уста­ новленных сроков, оценивались соответствующие показатели у контрольных животных.

3.1 Концентрация восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп белков в тканях печени, почек, головного мозга экспериментальных животных при повторном введении циклофосфана 3.1.1. Концентрация восстановленного глутатиона Проведенное исследование позволило определить основные тенденции изменения показателей системы глутатиона, характеризующие как компенсаторные механизмы, так и процессы декомпенсации изучаемой системы.

Так, концентрация ВГ в тканях печени при введении токсиканта в дозе 20 мг/кг на 3 сутки эксперимента незначительно повышалась и к 5 дню исследования составила 123,1% (р0,05) от уровня контроля. В более поздние сроки наблюдалось постепенное снижение концентрации восстановленной формы трипептида до уровня физиологической нормы (табл. 2).



Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 22 |
 


Похожие материалы:

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.