5 9 3 минаева любовь валерьевна ^/-/emaci^cl^ эксперртментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения цржлофо

Введение ЦФ в дозе 40 мг/кг вызывало более глубокие изменения, о чем свидетельствует непродолжительная длительность компенсаторного увеличения концентрации ВГ, максимальное значение которой на 3 сутки Изменения концентрации восстановленного глутатиона в тканях различных органов белых беспородных крыс при по­ вторном введении циклофосфана в суточных дозах 20 и 40 мг/кг (ммоль/г ткани или мкмоль/г гемоглобина) Грзшпа иссле­ Циклофосфан, 20 мг/кг * - достоверность отличия р0,05 по сравнению с группой контроля эксперимента превысило показатели интактной группы на 23,2% (р0,05).

С 5 дня исследования начиналось постепенное снижение уровня ВГ.

В тканях почек основная направленность изменений исследуемого показателя сохранялась, но была менее выражена. Применение ЦФ в дозе мг/кг сопровождалось незначительным повышением концентрации ВГ на сутки исследования, с последующим снижением к исходу эксперимента.

Введение токсиканта в более высокой дозе привело к максимальному повышению концентрации ВГ на 3 сутки, с последующим восстановлением показателя до контрольных значений на 7 сутки исследования.

Концентрация ВГ в тканях головного мозга достоверно не изменялась на протяжении всего периода исследования.

Таким образом, степень и длительность изменений концентрации ВГ в тканях различных органов при повторных интоксикациях веществами алкилрфующего действия зависит от дозы вводимого токсиканта, от участия органа в метаболизме и детоксикации используемого ксенобиотика и особенностей внутритканевого обмена глутатиона.

3.L2. Концентрация сульфгидрильных групп белков в тканях печени, почек, головного мозга лабораторных животных при повторном введении Поддержание тиол-дисульфидного равновесия - ведущего регуляторного фактора активности ряда ферментативных систем, находится в непо­ средственной зависимости от изменений обмена глутатиона. Проведенное исследование позволило установить некоторые особенности динамики изме­ нения концентрации СГ в исследуемых тканях (табл. 3).

В тканях печени уровень снижения СГ достаточно надежно отражает степень повреждения системы глутатиона и начало срыва ее компенсатор­ ных ресурсов. Так, введение ЦФ в дозе 20 мг/кг приводило к постепенному Изменения концентрации сульфгидрильных групп тканевых белков в тканях различных органов белых беспородных крыс при повторном введении циклофосфана в суточных дозах 20 и 40 мг/кг (мкмоль/г ткани или мкмоль/г гемоглобина) Группа иссле­ Циклофосфан, - достоверность отличия р0,05 по сравнению с группой контроля снижению уровня СГ на протяжении всего периода исследования, на 10 сутки данный показатель составил 85,5% (р0,05) от контрольных значе­ ний. Инъекции более высокой дозы токсиканта вызывали существенное па­ дение уровня СГ: уже на 7 сутки эксперимента снижение показателя соста­ вило 16,3% (р0,05). В отличие от двухфазного характера изменений кон­ центрации ВГ в тканях печени, период компенсаторного повышения уровня СГ отсутствовал.

В тканях почек четко прослеживался период компенсаторных измене­ ний. Уровень СГ, постепенно нарастая, к 5 дню исследования достиг макси­ мального значения, которое превысило контроль на 30,0% (р0,05), при вво­ димой дозе токсиканта 20 мг/кг, с последующей тенденцией к снижению данного показателя к исходу эксперимента. При использовании ЦФ в дозе мг/кг повышение уровня СГ наблюдалось в течение 1 суток.

В тканях головного мозга введение ЦФ в дозах 20 и 40 мг/кг не сопро­ вождалось достоверными сдвигами концентрации СГ.

Сравнительный анализ зфовня сульфгидрильных групп белков в тка­ нях отравленных животных в динамике указывает на наличие выраженного дозозависимого характера данных изменений. Использование ЦФ в дозе, равной 40мг/кг, вызывало более выраженные и продолжительные нарушения тиол-дисульфидного баланса во всех исследуемых тканях. Одновременно наблюдались и межорганные отличия, с преимущественным падением уров­ ня СГ в тканях печени.

3.2. Активность ферментов системы глутатиона в тканях печени, по­ чек, головного мозга экспериментальных животных при повторном введении Анализ литературы, проведенный в предыдущей главе исследования, позволяет рассматривать систему глутатиона как саморегулирующуюся био­ химическую систему [43,44]. Ферменты, входящие в состав этой системы.

Принимают участие как в восстановлении глутатиона из окисленной формы - глутатионредуктаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, так и осуществляют антиоксидантное воздействие - глутатионпероксидаза, глутатион-Sтрансфераза и каталаза.

Степень нарушения состояния системы глутатиона, в том числе и де­ компенсацию ее функциональных возможностей, по-видимому, следует оце­ нивать не только исходя из определения таких параметров, как уровень вос­ становленного глутатиона и сульфгидрильных групп белков, но и из уровня активности входящих в нее ферментов обмена глутатиона.

Приведенные ниже экспериментальные данные позволяют говорить о задействованности изменений ферментативного звена обмена глутатиона в патогенезе цитотоксического действия при повторных интоксикациях веще­ ствами алкилирующего действия.

3.2.1. Активность ферментов, участвующих в восстановлении глутатиона из окисленной формы в тканях печени, почек, головного мозга экспериментальных животных при повторном введении циклофосфана Эффективное выполнение системой глутатиона таких функций, как антирадикальная защита и поддержание тиол-дисульфидного равновесия осуществляется благодаря сохранению достаточного зфовня ВГ в тканях, поддержание которого в клетках происходит 2 путями: путем синтеза глута­ тиона de novo в у-глутамилтрансферазном цикле и путем восстановления его из окисленной формы. При этом активность глутатионредуктазы и основно­ го источника НАДФН в тканях - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реак­ ции оказывается лимитирующим фактором поддержания уровня ВГ в тка­ нях, так как скорость его синтеза в тканях намного ниже НАДФНзависимого восстановления окисленной формы глутатиона под действием ГР Исследование активности Г-6-Ф-ДГ и ГР в различных тканях живот­ ных при повторных интоксикациях ЦФ позволило установить, что измене­ ния их активности тесно связаны с формированием цитотоксического эф­ фекта (табл. 4,5).

3.2.1.1. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в тканях печени, почек, головного мозга экспериментальных животных при повторном введении Сравнительная оценка динамики активности Г-6-Ф-ДГ в тканях пече­ ни, почек и головного мозга позволила выявить следующие закономерности.

В тканях печени изменения активности фермента были наиболее вы­ раженными. Достоверное снижение активности Г-6-Ф-ДГ наблюдалось на протяжении всего исследования, и на 10 сутки после введении ЦФ в дозе мг/кг активность ее уменьшилась в 2,4 раза (р0,05) по сравнению с кон­ трольной группой, а при использовании большей дозы на 7 сутки в 2,6 раза (р0,05).

Изменения, происходившие в тканях почек и головного мозга, носили сходный характер: на 3 сутки после введения ЦФ в дозе 20 мг/кг активность исследуемого фермента незначительно повышалась, с последующим сниже­ нием на 10 сутки ниже контроля на 18,9% (р0,05) в тканях почек или до по­ казателей интактной группы в тканях головного мозга. После использования токсиканта в суммарной дозе 400 мг/кг длительность компенсаторного пе­ риода сокращалась, а выраженность угнетения активности Г-6-Ф-ДГ в тка­ нях этих органов усиливалась. Максимальное повышение активности фер­ мента в тканях почек и мозга отмечалось через 1-3 сутки. Последующее снижение наблюдалось в тканях почек на 23,7% (р0,05) ниже значений кон­ трольной группы и на 13,9% (р0,05) - в тканях головного мозга.

Таким образом, отравления веществами алкилирующего действия со­ провождаются заметными сдвигами глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной акТаблица Изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в тканях различных органов белых беспородных крыс при по­ вторном введении циклофосфана в суточных дозах 20 и 40 мг/кг (мкмоль/(мин • г белка) или Группа иссле­ Циклофосфан, * - достоверность отличия р0,05 по сравнению с группой контроля Изменения активности глутатионредуктазы в тканях различных органов белых беспородных крыс при повторном вве­ дении циклофосфана в суточных дозах 20 и 40 мг/кг (мкмоль/(мин • г белка) или ммоль/(мин • г гемоглобина) Группа иссле­ Циклофосфан, 20 мг/кг * - достоверность отличия р0,05 по сравнению с группой контроля ТИВНОСТИ в тканях. Прослеживается четкая дозозависимая направленность изменений активности ключевого фермента пентозофосфатного цикла: наи­ более раннее и выраженное угнетение, которого отмечается при введении большей дозы ксенобиотика. В тканях печени изменения активности фер­ мента носрши однофазный характер, отсутствие периода адаптации, выра­ женное снижение активности фермента, связано с неблагоприятными изме­ нениями условий функционирования данного показателя, что соответствен­ но приводит к разбалансировке работы всей системы глутатиона. В тканях почек и головного мозга изменения активности Г-6-Ф-ДГ были менее значи­ тельными, период непродолжительного компенсаторного увеличения актив­ ности сменялся достоверным уменьшением определяемого показателя ниже значений контроля.

3.2.1.2. Активность глутатионредуктазы в тканях печени, почек, головного мозга белых беспородных крыс при повторном введении циклофосфана В своем исследовании B.B.Anderson et al. [80] отмечают наличие вза­ имного влияния активностей глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и глутатион­ редуктазы. Эти ферменты включены в единую систему, предназначение ко­ торой - редукция глутатиона из окисленной формы в восстановленную.

Взаимосвязь этих ферментов осуществляется как на субстратном уровне че­ рез НАДФН, который необходим для осуществления глутатион-редуктазной реакции, так и благодаря наличию единых механизмов регуляции фермента­ тивной активности. В проведенном исследовании также было выявлено на­ личие определенного сходства изменений глюкозо-6фосфатдегидрогеназной и глутатионредуктазной активности.

В ткани печени при использовании различных доз токсиканта отмеча­ лись двухфазные изменения глутатионредуктазной активности. Так, при применении ксенобиотика в суточной дозе 20 мг/кг активность ГР в тканях этого органа первоначально незначительно повышалась, а затем падала даже ниже значений интактного контроля на 28,5% (р0,05) на 10 сутки после введения ЦФ. Более высокая из используемых доз токсиканта через сутки вызывала выраженное снижение активности фермента в тканях печени, ко­ торая уже через 7 суток эксперимента снижалась в 1,82 раза (р0,05).

В тканях почек и головного мозга отравленных животных тенденция к повышению глутатионредуктазной активности появлялась только в первые сутки после введении ЦФ в малой дозе, с последующей тенденцией умень­ шения активности. Вместе с тем, введение ксенобиотика в дозе 40 мг/кг при­ водило к значительному падению данного показателя, уровень которого на сутки был ниже контрольного на 30,7% (р0,05) в тканях почек и на 23,8% (р0,05) в тканях мозга.

Повышение активности ГР на начальных этапах эксперимента, отме­ чаемое во всех тканях при введении ЦФ в дозе 20 мг/кг, по-видимому, может свидетельствовать об адаптивных изменениях в системе глутатиона и сохра­ нении резервов поддержания достаточного уровня ВГ. В свою очередь, по­ следующее угнетение глутатионредуктазной активности в тканях всех орга­ нов, особенно выраженное после использования ксенобиотика в дозе мг/кг, говорит об истощении резервов исследуемой биохимической системы в условиях повторной интоксикации ЦФ, что может свидетельствовать о глубоких нарушениях функции ее саморегуляции. Снижение глутатионре­ дуктазной активности может стать причиной падения уровня ВГ и угнетения активности ферментов, использующих его для утилизации продуктов пероксидации - глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы и усугублении цитотоксического эффекта применяемого токсиканта.