5 9 3 минаева любовь валерьевна ^/-/emaci^cl^ эксперртментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения цржлофо

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы повышения рабо­ тоспособности и восстановления здоровья военнослужащих и гражданского населения в условиях чрезвычайных ситуаций» (Санкт-Петербург, 2006 г.).

Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы химической безопасности в Российской Федерации» (Санкт-Петербург, г.), на итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ор­ динаторов 1 факультета (Санкт-Петербург, 2007 г.). Всероссийской научнопрактической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007 г.).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 18 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, общую характеристику материалов и мето­ дов исследования, полученные результаты и их обсуждение, заключение и выводы.

Работа изложена на 178 страницах машинописного текста, содер­ жит 21 рисунок и 20 таблиц. Список литературы состоит из 161 источник, из них 76 отечественных и 85 иностранных авторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Система глутатиона и ее биологическое значение 1.1.1. Биологическое значение и структура системы глутатиона Токсические агенты нарушают молекулярные механизмы гомеостаза клетки. Это действие приводит к изменению фундаментальных клеточных реакций, определяющих, в свою очередь, функции конкретного органамишени.

В настоящее время выделяют следующие основные механизмы ток­ сичности на клеточном уровне [117]:

1. Реакции, опосредованные взаимодействием токсиканта с рецептора­ ми.

2. Повреждения и нарушения целостности клеточной мембраны.

3. Изменение энергетического метаболизма клеток.

4. Расстройства системы регуляции гомеостаза ионов кальция.

5. Связывание ксенобиотика с жизненно важными клеточными макро­ молекулами.

6. Токсичность, опосредованная конъюгацией с глутатионом.

В процессе эволюции выработались определенные способы адаптации организма к действию химических веществ, включающие токсикокинетические, структурные, иммунологические, метаболические, токсикодинамические механизмы. Ведущую роль при этом играют метаболические механизмы, направленные на обезвреживание токсических веществ. Эти ме­ ханизмы включают 4 группы реакций: энзиматическую биотрансформацию ксенобиотиков при участии цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ ( фаза биотрансформации), конъюгацию реактивных метаболитов и гидро­ фильных соединений (2 фаза биотрансформации), синтез макроэргических соединений, необходимых для осуществления реакций конъюгации, и антиперекисные механизмы. Этот комплекс реакций, встречающихся во всех живых организмах от растений до высших животных и человека, рассматривается как универсальная биологическая система естественной детокВщрщвдш[|1б4Й29б^Спечении 2 фазы биотрансформации ксенобиотиков принадлежит системе глутатиона, значение которой для организма много­ гранно.

Глутатион - у-глутамилцистеинилглицин, представляет собой непра­ вильный трипептид, включенный в одну из систем обмена - систему глутатиона. В организме глутатион представлен двумя основными формами восстановленной (ВГ) и окисленной (ОГ), имеющими следующее структур­ ное строение [63,43]:

Биологическое значение системы глутатиона многообразно и затраги­ вает практически все стороны жизнедеятельности клеток:

1) конъюгация ксенобиотиков и их метаболитов [20,47,69,70,153];

2) защита от повреждающего действия АФК и реакционноспособных метаболитов ксенобиотика [36,43,45];

[43,65,134,135,140,161];

4) поддержание восстановленной среды клетки [43,135];

5) регулирующее влияние на углеводный, липидный и белковый обмены путем взаимодействия восстановленной и окисленной формы глута­ тиона при физиологических концентрациях с рядом белков и ферментов [43,134,136];

6) поддержание гемоглобина эритроцитов в восстановленном со­ стоянии, восстановление метгемоглобина и защита эритроцитов от гемолиза [43];

127,137,138,139];

8) поддержание оптимального состояния и функций биологических мембран [127];

9) участие в синтезе нуклеиновых кислот и белков [43,45,127];

10) регуляция процессов клеточной пролиферации и опухолевого роста [26,43,45,104,127];

11) участие в механизмах старения клетки [104,119,141,142];

12) участие в обмене ряда эйкозаноидов - простагландинов и лейкотриенов [30];

13) резерв цистеина в клетке [43,138];

14) участие в регуляции функциональной активности лимфоцитов и обеспечении иммунного ответа организма [30,113,125];

15) регуляция синтеза белков теплового шока, обеспечивающих за­ щиту клетки от денатурированных белков и, возможно, вызывающих их ренатурацию [29,97];

16) участие в механизмах адаптации к гипоксии [17,37,55];

17) препятствие реализации механизмов клеточной гибели (некроз и апоптоз) [20,38,43,138,142,160];

18) участие в реализации механизмов глутаматной эксайтотоксичности и ишемического повреждения тканей головного мозга [21,26].

Последние современные исследования только расширяют представле­ ния о биологических функциях системы глутатиона.

В обмене глутатиона принимают участие несколько ферментных сис­ тем. Приведенная ниже схема, разработанная A.Meister и M.E.Anderson, де­ монстрирует основные реакции его обмена (рис. 1).

Cys-Gly Y-Glu-CysX NAc-CysX Рис.1. Основные направления метаболизма глутатиона [138] Таким образом, в сложном процессе обмена глутатиона принимает участие несколько ферментных систем:

1. Ферменты синтеза и распада глутатиона, образующие углутамилтрансферазный цикл: у-глутамилцистеинсинтетаза /КФ 6.3.2.2/ (1), глутатионсинтетаза /КФ 6.3.2.3/ (2), у-глутамилтрансфераза /КФ 2.3.2.2/ (3), у-глутамилциклотрансфераза (4), 5-оксопролиназа /КФ 3.5.2.1/ (5) и дипептидазы (6).

2. Фермент, участвующий в процессе необратимого связывания восстановленного глутатиона с разнообразными субстратами как экзо-, так и эндогенного происхождения, глутатион-8-трансфераза (7).

3. Ферменты, функции которых связаны с окислением восстанов­ ленной формы глутатиона в его дисульфид - ОГ. В этой группе можно выде­ лить ферменты антиоксидантной защиты: Se-зависимую глутатионпероксидазу /КФ 1.11.1.9/, фосфолипид-гидропероксидглутатионпероксидазу (9), глутатион-8-трансферазу /КФ 2.5.1.18/ при осуществлении ею «Seнезависимой глутатионпероксидазной» функции (9), а также ферменты, от­ носящиеся к глутатионовой дисульфидредуктазной системе: протеиндисульфидизомераза /КФ 5.3.4.1/ и тиолтрансфераза /КФ 1.8.4.4/ (10).

4. Ферменты, принимающие участие в восстановлении ОГ в ВГ. К ним относятся глутатионредуктаза /КФ 1.6.4.2/ (10) и условно глюкозо-6фосфатдегидрогеназа /КФ 1.1.1.49/ (11).

Однако, приведенная выше схема обмена глутатиона не позволяет в полной мере отобразить все биохимические процессы, в которых участвует данное соединение. Причисление к системе глутатиона дипептидаз (6) и ацетилаз (8), имеющих важное значение в процессе глутатионовой конъюгации липофильных ксенобиотиков, является условным.

Синтез и распад глутатиона осуществляется в у-глутамилтрансферазном цикле. Синтез происходит в 2 этапа: под действием у-глутамилцистеинсинтетазы и глутатион синтетазы. Первый фермент является ключевым, ре­ гуляция его активности (и синтеза ВГ в целом) осуществляется по принципу обратной связи путем ингибирования восстановленным глутатионом [95,147].

Распад глутатиона на первом этапе катализируется у-глутамилтрансферазой (ГГТФ), которая является ключевым ферментом данного процесса. Дальнейшее превращение глутатиона до аминокислот происходит под действием у-глутамилциклотрансферазы, 5-оксопролиназы и дипептидаз.

Распад глутатиона тесно связан с трансмембранным переносом аминокис­ лот, так как в его результате образуется у-глутамил-производное аминокис­ лоты и дипептид - цистеинилглицин [138,139]. Кроме того, ГГТФ принимает участие во втором этапе глутатионовои конъюгации, под ее воздействием от комплекса глутатион-субстрат происходит отщепление остатка глутаминовой кислоты [20]. Регуляция активности ГГТФ (и скорости распада ВГ) в тканях происходит при участии цАМФ-зависимого протеинкиназного меха­ низма [42]. Так, рост содержания цАМФ в тканях (например, при активации симпатоадреналовой системы) вызывает снижение активности ГГТФ и по­ вышение внутриклеточной концентрации ВГ.

Несмотря на сложность системы обмена глутатиона, он совершается достаточно быстро. Период полуобмена ВГ составляет в плазме крови около 2 мин, в почках - 30-50 мин, в макрофагах - менее 2 ч, в печени и слизистой кишечника - около 3 ч, в головном мозге - 71 ч, в эритроцитах, селезенке и легких - около 96 ч [43]. При этом скорость полуобмена в различных тканях (в пересчете на грамм) составляет; 24,00-10" моль/мин (почки), 4,77-10' (пе­ чень), 0,1 Г10"^ (головной мозг) и 0,12-10'^ (эритроциты). Данные межткане­ вые различия в скорости функционирования у-глутамилтрансферазного цик­ ла обусловлены не интенсивностью синтеза ВГ, которая приблизительно равна во всех клетках, а скоростью распада трипептида [138]. Так, актив­ ность ГГТФ в тканях существенно различается: она наиболее высока в поч­ ках и значительно ниже в печени, мышцах, легких, головном мозге и прак­ тически не определяется в эритроцитах и макрофагах [20].

Таким образом, расщепление глутатиона до аминокислот наиболее ин­ тенсивно осуществляется в почках, в тканях которых высока активность ГГТФ, у-глутамилциклотрансферазы, 5-оксопролиназы и дипептидаз [44] и, кроме того, существуют системы активного транспорта ВГ в клетки [127]. В связи с тем, что большинство тканей способны секретировать избытки ВГ в Кровь [138], существует определенный цикл превращений глутатиона между тканями и почками. Скорость выделения глутатиона больше в тех тканях, где интенсивность его наработки превышает активность ГГТФ, поэтому ос­ новным источником ВГ плазмы крови является печень.

В исследованиях A.Meister [137,138] показано, что поглощение клет­ ками молекул ВГ и ОГ из межклеточного пространства в большинстве тка­ ней невозможно из-за отсутствия систем транспорта, поэтому рост внутри­ клеточной концентрации глутатиона обеспечивается только за счет амино­ кислот-предшественников, для которых существует по меньшей мере шесть систем транспорта [107]. Но в настоящее время приводятся данные о воз­ можности при определенных условиях пассивного переноса ВГ в клетки и осуществления активного транспорта ОГ во внутриклеточную среду [131,132].

1.1.3. Роль глутатиона в биотрансформации ксенобиотиков Особенностью действия упоминаемой выше глутатионтрансферазы является то, что этот фермент осуществляет не только пероксидазную реак­ цию, но и необратимую конъюгацию ВГ с липофильными токсическими со­ единениями, причем не только с вторичными продуктами пероксидации (4гидроксиалк-2-еналями, эпоксидами и холестерин-а-оксидом) [22,77], но и с другими субстратами, обладающими достаточно электрофильным центром [43,135]. Это позволяет отнести глутатионтрансферазу ко второй группе ферментов обмена глутатиона.