5 9 3 минаева любовь валерьевна ^/-/emaci^cl^ эксперртментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения цржлофо
Под влиянием ЦФ происходит снижение митотического индекса и торможение синтеза ДЬЖ. Угнетение синтеза ДНК приводит к увеличению средней продолжительности фаз S и Gj, вызывает первичное и вторичное блокирование фазы Gi. ЦФ способен нарушать клеточный цикл и в фазе Go, но только после вступления этих клеток в деление, что может приводить к блокированию его в фазах S и Gi. Изменения, вызванные ЦФ в клеточном цикле опухоли, довольно стабильны [41]. Повреждение ДНК объясняет и мутагенный эффект ЦФ, который особенно четко проявляется в клетках красного костного мозга при введении препарата в высоких дозах. При этом возникает множество хромосомных аберраций, преимущественно хроматидного типа, что позволяет отнести ЦФ к мутагенам «задержанного» действия.
1.2.4. Повреждающее действие ЦФ на биологические мембраны В механизме действия препарата важная роль придается также повре ждению структуры биологических мембран. С одной стороны, активные ме таболиты ЦФ могут алкилировать структурные мембранные белки, нарушая тем самым их специфические функции. С другой, в процессе биотрансфор мации ЦФ в клетке под действием цитохрома Р-450 происходит образование активных форм кислорода (АФК), которые запускают процессы свободнорадикального окисления (СРО).
СРО является цепным самоиндуцирующимся процессом непосредст венного переноса кислорода на субстрат с образованием перекисей, альдеги дов, кетонов [35]. Сам по себе кислород опасности для клетки не представ ляет, но, в силу уникальности электронной структуры [60], его восстановле ние приводит к образованию активных и токсических интермедиатов, таких как супероксидный анион (Ог ), гидроксильный радикал (ОН), перекись во дорода (Н2О2) и т.д. [60]. Супероксиданион образуется в результате одноэлектронного восстановления кислорода за счет НАДФН [108]. Суперокси данион под действием фермента супероксиддисмутазы превращается в пере кись водорода, которая, в свою очередь, в присутствии двухвалентного же леза может модифицироваться в гидроксильный радикал. Кроме того, и су пероксиданион способен вступать во взаимодействие с перекисью водорода по реакции Габер-Вейса, что также приводит к образованию самого активно го из инициаторов СРО гидроксильного радикала - продукта трехэлектронного восстановления кислорода [13,61]:
Гидроксильный радикал отвечает за целый ряд токсических эффектов, особенно в присутствии металлов переменной валентности, среди которых максимальной способностью активировать СРО обладают ионы железа [60].
Следует отметить, что в инициации СРО участвует также синглетный кислород, а все перечисленные промежуточные метаболиты - продукты вос становления кислорода - чрезвычайно реакционноспособны и могут само стоятельно запускать новые цепи радикальных реакций [61].
Реакциям СРО с участием АФК подвергаются аминокислоты, белки, углеводы, но для организма решающее значение имеет окисление ФЛ и НеЖК [35]. Во всех НеЖК имеется дивинилметановая структура, которая легко вступает в реакцию отрыва водорода от атома углерода в а-положении от двойной связи, что приводит к образованию стойких свободных радика лов, а в присутствии кислорода - к образованию перекисного радикала, а за тем и перекиси [13,60,61]. Из-за наличия двух сопряженных связей данные первичные продукты окисления НеЖК получили групповое название диено вые конъюгаты (ДК).
Гидроперекисный радикал и гидроперекиси липидов запускают новые цепи свободнорадикальных реакций, что замыкает порочный круг и создает благоприятные условия для выхода процесса из-под контроля защитных гомеостатических систем. Первичные продукты ПОЛ представляют собой не достаточно устойчивые вещества, которые подвергаются дальнейщему окис лению с образованием более устойчивых вторичных продуктов: альдегидов, кетонов, спиртов и низкомолекулярных кислот (муравьиной, уксусной, мас ляной) [11]. Среди продуктов ПОЛ, образовавшихся в результате повторных атак окислителей на НеЖК, ключевое место занимает малоновый диальдегид (МДА).
Учитывая, что основной субстрат липидной пероксидации - НеЖК является обязательным компонентом любой биологической мембраны [35], негативные последствия стимуляции реакций ПОЛ отражаются в первую очередь на состоянии всех без исключения клеточных мембран. Включение в состав НеЖК гидроперекисных группировок повышает их гидрофильность, что приводит к взаимной переориентации жирнокислотных остатков и объединению их в перекисные кластеры. Появление последних приводит к возникновению новых каналов проводимости вследствие латеральной диф фузии молекул в мембране, снижению текучести и повышению жесткости мембран, нарушению белок-липидных взаимодействий, что препятствует конформационным изменениям ферментов в ригидном матриксе и приводит к снижению их активности. Появление зон с различной вязкостью может со провождаться концентрированием, полимеризацией и изменением сродства измененных рецепторов к гормонам [11,13]. Между карбонильными произ водными, образовавшимися при окислении НеЖК (в первую очередь, мало новым диальдегидом, а также другими альдегидами и кетонами), и аминосодержащими компонентами (аминокислоты и их эфиры, белки, нуклеиновые кислоты, фосфатидилэтаноламин) формируются ковалентные межмолекулярные сшивки. При этом синтезируются ненасыщенные вещества, содер жащие 1-амино-З-имино-группировку, общего строения типа R-N=CH CH=CH-NH-R, получившие название шиффовых оснований. Этот процесс усугубляет инактивацию белков и нуклеиновых кислот.
Сходные мембранные изменения касаются и внутриклеточных мем бран: по новым каналам проводимости в клетку устремляются ионы кальция, которые мощно активируют фосфолипазы, освобождающиеся из лизосом.
Освобождающиеся при этом лизоформы ФЛ и свободные жирные кислоты обладают детергентными свойствами, что еще более разупорядочивает мем браны (хаотропный эффект) и делает их более подверженными ПОЛ [35].
Таким образом, замыкается порочный круг и развивается так называемый оксидативный стресс. Цепь преобразований становится неуправляемой ^^е в том случае, когда реакциям ПОЛ подвергается всего 2-5% от общего содер жания ФЛ в мембранах [35]. В конечном итоге чрезмерная активация ПОЛ приводит к цитолизу.
1.2.5. Действие ЦФ на энергетический обмен Еще одним звеном патогенеза при поражении алкилирующими соеди нениями является развитие острого энергетического дефицита в тканях в ре зультате нарушения клеточного дыхания. Выше отмечалось как прямое, так и опосредованное поражение ферментных систем клетки, приводящее и к ингибированию ферментов тканевого дыхания. Этому способствует прямое действие яда - алкилирование и нарушение синтеза ферментов de novo [8].
Немаловажное значение придается и разобщающему действию алкилирующих соединений на процессы дыхания и фосфорилирования [8]. Возможно, что нарушение окислительного фосфорилирования связано с алкилированием компонентов дыхательной цепи, в частности сукцинатдегидрогеназы, а также АТФ-синтетазы [8] и белковых ионных каналов внутренней мембраны митохондрий. Алкилирование ферментов клеточного дыхания метаболитами циклофосфана и, как следствие, развитие тканевой гипоксии приводит к утечке активных форм кислорода с терминального участка дыхательной це пи.
Повреждение внутренней и наружной мембран митохондрий является одним из наиболее ранних морфологических проявлений цитотоксического действия алкилирующих агентов [16]. Повреждения митохондриальных мембран выявляются также и при ультраструктурном исследовании [77].
Поврежденные и, следовательно не участвующие в процессе транспотра электронов, митохондриальные мембраны значительно легче подвергаются перекисной деградации, продуцируя эндогенные разобщители окисления и фосфорилирования [63].
Еще одной из возможных причин нарушения тканевого дыхания мо жет служить снижение содержания внутриклеточного НАД под воздействи ем алкилирующих ядов. Снижение уровня НАД связывают с активацией АДФРТ в результате апкилирования нуклеотидов ДНК и образования «апуриновых» локусов. В то же время, цитофотометрически обнаружено, что со держание пиридиннуклеотидов в опухоли уменьшается лишь через 3-4 дня после введения ЦФ, а отчетливые морфологические изменения в опухолевых клетках обнаруживаются уже в течение первых суток [62].
Фактором, ограничивающим энергетическое обеспечение организма при отравлении алкилирующими агентами, является также и вторичная тка невая гипоксия в результате нарушения переноса кислорода. У наиболее сильно пострадавших от поражения ипритом при бомбардировке итальян ского порта Бари в 1943 г. отмечались выраженная гипотония и брадиаритмия. Это связано с воздействием высоких доз токсиканта на холинореактивные структуры. При этом наблюдается «мускариноподобный» эффект при воздействии на железы и гладкую мускулатуру и «никотиноподобный» эф фект при действии на вегетативные ганглии и скелетные мышцы [46].
1.2.6. Роль системы глутатиона при отравлениях ЦФ.
Необходимо отметить, что несмотря на огромный интерес к системе глутатиона, ее роль в патогенезе повторных интоксикаций алкилирующими ядами и, в частности, ЦФ определена далеко не до конца. Большое количест во исследований посвящено изучению активности ГТ как фермента ответст венного за резистентность опухолевых клеток к терапии ЦФ. Экспрессия изофермента ГТ А1-1, имеющего самую низкую Кщ, приводит к увеличению конъюгации фосфорамидиприта и глутатиона и, как следствие, к развитию устойчивости к цитотоксическим эффектам ЦФ [110]. Было проведено экс периментальное исследование, направленное на изучение системы глутатио на и процессов ПОЛ в тканях печени, почек, головного мозга и в эритроци тах крыс при острых отравлениях ЦФ в высоких дозах. Анализ полученных результатов показал, что характер изменений изученных биохимических показателей в исследуемых органах зависит от дозы введенного ЦФ, участия ткани в метаболизме ксенобиотика и межтканевых особенностей обмена глутатиона. При этом были получены данные, свидетельствующие об исто щении пула ВГ, снижении активности ГР, ГТ, ГП, Г-6-Ф-ДГ, каталазы, уве личении продуктов ПОЛ при введении ЦФ в дозах 2 LDso и LDso [31].
Несмотря на наличие большого количества исследований, посвящен ных проблеме использования ЦФ, практически отсутствуют работы, в кото рых проводилась бы оценка системы глутатиона в различных органах при повторной интоксикации данным ксенобиотиком в малых дозах. В настоя щее время отсутствует оценка изменений, происходящих в ферментной сис теме глутатиона в условиях повторного введения ЦФ, не определено значе ние этих сдвигов на выполнение системой глутатиона своих биологических функций, в частности, антиоксидантной защиты клетки. Малое количество работ посвящено влиянию на систему глутатиона фармакологической кор рекции с помощью современных антиоксидантов и антигипоксантов в усло виях повторного введения ЦФ. Для выяснения особенностей функционирования системы глутатиона в условиях повторного токсического воздействия ксенобиотика необходимо комплексное исследование данной биохимиче ской системы и сопряженных процессов при повторном воздействии ЦФ в малых дозах на ткани различных органов.
«