5 9 3 минаева любовь валерьевна ^/-/emaci^cl^ эксперртментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения цржлофо

В экспериментальной части работы, изучалось влияние повторных введений ЦФ (в течение 1-10 суток) в дозах 20, 40 мг/кг массы животного ежесуточно и ряда фармакологических препаратов (ацетилцистеин, мексидол, трисан, цитофлавин, глутоксим, литан) в условиях повторной интокси­ кации ксенобиотиком в дозе 20 мг/кг в течение 10 суток на состояние систе­ мы глутатиона и ПОЛ в различных тканях белых беспородных крыс.

Фармакологические препараты, используемые для коррекции токсиче­ ского эффекта повторной интоксикации ЦФ, способны проявлять следую­ щие фармакотерапевтические эффекты:

- антиоксидантный - индукция синтеза глутатиона (ацетилцистеин);

- антиоксидантный - нейтрализация АФК, продуктов ПОЛ (цитофла­ вин, мексидол);

- антигипоксический - снижение потребности клеток в кислороде (трисан);

- детоксимодифицирующий - индукция синтеза ферментов детоксикации ксенобиотиков (глутоксим);

- гемостимулирующий - увеличение доступного пула реутилизируемого железа (литан).

Состояние системы глутатиона при повторных введениях ЦФ оцени­ вали в тканях печени, почек, головного мозга и в эритроцитах лабораторных животных на основе исследования уровня низкомолекулярных (восстанов­ ленный глутатион) и белковых сульфгидрильных групп, а также активности некоторых ферментов, непосредственно определяющих состояние указанной биохимической системы и сопряженных с ней систем:

1) ферментов, участвующих в восстановлении окисленной формы глута­ тиона: глутатионредуктазы, а также ключевого фермента пентозофосфатного шунта и основного поставщика кофермента глутатионредуктазной реакции НАДФН - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы;

2) глутатионзависимых антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы и глутатион-8-трансферазы, а также основного синергиста глутатионпероксидазы в реакции обезвреживания перекиси водорода - каталазы;

3) фермента глутатионовой конъюгации - глутатион-S-трансферазы.

Для оценки интенсивности протекания процессов перекисного окисле­ ния липидов в условиях повторных отравлений ЦФ в исследуемых тканях определяли концентрации первичных и вторичных продуктов ПОЛ ~ диено­ вых конъюгатов и малонового диальдегида.

Концентрацию восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, продуктов ПОЛ и активность вышеперечисленных ферментов в ис­ следуемых тканях проводили спектрофотометрическими методами. Выбор этих методов исследования определялся их высокой информативностью и точностью, относительно небольшим количеством необходимого для иссле­ дования материала, возможностью проведения обследования всех животных одномоментно по всем вышеперечисленным показателям. Важным достоин­ ством спектрофотометрического метода исследования является то, что он не требует дополнительного специального оборудования и может легко вос­ производиться в любых клинико-диагностических лабораториях, что позволяет проводить сравнение полученных результатов с данными других авто­ ров.

Экспериментальные исследования выполнены на 180 белых беспород­ ных крысах-самцах массой 190-210 г из питомника РАМН «Рапполово». Со­ держание и использование животных в эксперименте проводилось согласно положениям, изложенным в работе И.П.Западнюка [23]. Животных содержа­ ли в виварии Военно-медицинской академии в пластмассовых клетках по голов при температуре воздуха 20°-22"С, естественном освещении, на под­ стилках из опилок деревьев лиственных пород. Рацион животных соответст­ вовал Приказу МО СССР №245 от 1982 г. и Приказу МЗ №1179 от 1983г.

Кормление осуществлялось ad libitum, в первой половине дня. Для марки­ ровки животных применяли спиртовой раствор пикриновой кислоты. Сопос­ тавимость экспериментальных групп обеспечивали рандомизацией выборок, использовавшихся в экспериментах.

Выбор животных для экспериментов определялся следующими факто­ рами:

1. Крысы являются стандартным объектом в биологических исследованиях.

2. Обладают сопоставимой с другими видами лабораторных животных и че­ ловеком чувствительностью к действию факторов химической природы и фармакологических препаратов.

3. Относительно низкой стоимостью этих животных.

2.2. Моделирование повторной интоксикации циклофосфаном В ходе экспериментального исследования проводили оценку влияния повторного введения циклофосфана (в течение 1-10 суток) в дозах 20, мг/кг ежесуточно на состояние показателей системы глутатиона и перекисного окисления липидов в различных тканях лабораторных животных в раз­ личные сроки исследования.

Моделирование повторной интоксикации ЦФ осуществляли согласно схеме гепатотоксического воздействия ЦФ, разработанной и описанной в статье «Фитофармакоррекция лекарственных гепатопатий» проф. Т.А. Ажуновой с соавторами [1].

Забой животных проводили через 1 сутки после введения ЦФ в пере­ численных дозах в течение 1, 3, 5, 7 и 10 дней.

При проведении фармакологической коррекции цитотоксического действия ЦФ через 30 мин после введения токсиканта в дозе 20 мг/кг живот­ ным внутрибрюшинно ежедневно вводили один из следующих препаратов в течение 10 суток:

1. Ацетилцистеин в виде 3 % водного раствора в дозе 150 мг/кг массы.

2. Трисан в виде 1 % водного раствора в дозе 15 мг/кг.

3. Цитофлавин в виде 10 % водного раствора в дозе 100 мг/кг.

4. Мексидол в виде 1 % водного раствора в дозе 100 мг/кг.

5. Глутоксим в виде 1% водного раствора в дозе 100 мг/кг.

6. Литан в виде 0,5% водного раствора в дозе 100 мг/кг.

Контрольным животным (интактным) в те же сроки внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в дозе 10 мл/кг массы.

После затравки и введения препаратов коррекции до момента забоя животные опытных групп содержались в тех же условиях, что и животные контрольной группы.

Схема проведения экспериментального исследования представлена в табл. Схема проведения экспериментального исследования группы циклофосфана 2.3. Характеристика использованных фармакологических препаратов Ацетилцистеин - предшественник синтеза глутатиона, производное серосодержащей аминокислоты цистеина, от которой отличается тем, что один водород аминогруппы замещен остатком уксусной кислоты. В клини­ ческой практике используется в качестве эффективного муколитического средства и гепатопротектора при отравлениях хлорированными углеводоро­ дами. Являясь предшественником синтеза глутатиона, по сообщениям ряда авторов, может оказывать цитопротекторное действие за счет активации синтеза восстановленного глутатиона в у-глутамилтрансферазном цикле [70]. В эксперименте использовался коммерческий препарат производства «HEXAL PHARMA GmbH», Германия.

Трисан - препарат растительного происхождения, обладающий выра­ женным антигипоксантным действием. По химической структуре представ­ ляет собой производное индолморфолина. Препарат способствует более эф­ фективному сопряжению окисления и фосфорилирования, ему присущи свойства переносчика электронов. У препарата выявлена также и антиоксидантная активность [32,58]. Препарат разработан ООО «Фармако - Трисан»

(Россия), Фармакологическим Комитетом МЗ РФ разрешен к клиническим испытаниям.

Мексидол - синтетический антиоксидант, обладающий выраженными антиоксидантными, антигипоксантными и мембраностабилизирующими свойствами. По химической структуре представляет собой 2-этил-6-метил-3оксипиридина сукцинат. С одной стороны, он имеет сходство с пиридоксином, с другой стороны, в его состав входит субстрат цикла Кребса - сукци­ нат, который оказывает стимулирующее воздействие на синтез макроэргов митохондриями [12,28]. Выпускается 0 0 0 «Фармасофт» (Россия).

Цитофлавин - комплексный препарат, содержащий сукцинат натрия, рибоксин, рибофлавин, никотинамид. Обладает цитопротекторным, антиги­ поксантным и антиоксидантным действиями. Оказывает положительный эффект на процессы биоэнергетики клетки, уменьшает продукцию свобод­ ных радикалов, повышает активность ферментов антиоксидантной защиты.

Препарат активирует окислительно-восстановительные ферменты дыхатель­ ной цепи митохондрий, стимулирует внутриклеточный синтез белка и нук­ леиновых кислот, способствует утилизации глюкозы, жирных кислот и ресинтезу макроэргов. Обладает антиишемическим действием, улучшает коро­ нарный и мозговой кровоток, ограничивает зону некроза и стимулирует репаративные процессы в миокарде. Препарат улучшает метаболические про­ цессы в ЦНС через у-аминобутиратный шунт нервной ткани (цикл Робертса) и обладает ноотропным действием [28,50]. Производится НТФФ «Полисан»

(Россия).

Глутоксим - бис-у-Ь-глутамил - L-цистеинил-бис-глицин синтетический аналог природного гексапептида - окисленного глутатиона.

Глутоксим обладает иммунокоррегирующей, гемостимулирующей актив­ ностью, повышает резистентность клеток и организма в целом при локаль­ ных и генерализованных хронических инфекциях, увеличивает эффектив­ ность химиотерапии в отношении внутриклеточных инфекций, устраняет проявления неспецифического синдрома хронических заболеваний.

Фармакологическая активность препарата Глутоксим определяется его спо­ собностью оказывать селективное воздействие на сульфгидрильные (тиоловые) группы поверхностно-клеточных и растворимых рецепторов, что при­ водит к восстановлению их функционально активной конформации и чув­ ствительности к регуляторным и транспортным молекулам пептидной при­ роды [15,72]. Выпускается ГОС НИИ ОЧБ (Санкт-Петербург).

Литан - литиевая соль окисленного глутатиона. Препарат проходит клинические испытания.

2.4. Получение образцов тканей для исследований С целью получения материала для исследований от лабораторных жи­ вотных производили декапитацию крыс. Полученную кровь стабилизирова­ ли 4% раствором цитрата натрия в соотношении стабилизатор: кровь 1:6 затем охлаждали и немедленно использовали в исследованиях. Извле­ ченные после декапитации органы: печень, почки и головной мозг, отмывали холодным физиологическим раствором от крови в течение 35-50 с и замо­ раживали в жидком азоте. Образцы хранились до момента исследования в сосуде Дюара с жидким азотом.

Перед исследованием ткани печени, почек и головного мозга лабора­ торных животных извлекали из жидкого азота, взвешивали, измельчали и гомогенизировали в микроизмельчителе тканей РТ-2 (Россия) с пестиковым гомогенизатором при 3000 об./мин, добавляя охлажденный до температуры 0°С 0,1 М калий-фосфатный буфер с рН 7,4 в соотношении ткань:буфер Полученный гомогенат использовали для определения концентрации восстановленного глутатиона, содержания сульфгидрильных групп белков, МДА и ДК. Время от момента размораживания тканей до отбора проб гомогенатов и осаждения в них белка кислотами не превышало 45-60 с.

Для определения активностей ГП, ГР, ГТ, Г-6-Ф-ДГ и каталазы ис­ пользовали очищенную цитоплазматическую фракцию, которую получали дифференциальным центрифугированием. Гомогенат переносили в пласти­ ковые стаканчики и центрифугировали в течение 20 мин при +4°С с ускоре­ нием 20000 g на центрифуге K-24D (Германия). Супернатант рецентрифугировали в течение 60 мин при +2°С при 44500 об./мин (ускорение 150000 g) с использованием ротора Туре 50 3.Ti на ультрацентрифуге L8-M («Beckman», США). Полученный супернатант использовали для определения активности исследуемых ферментов.