5 9 3 минаева любовь валерьевна ^/-/emaci^cl^ эксперртментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения цржлофо
В экспериментальной части работы, изучалось влияние повторных введений ЦФ (в течение 1-10 суток) в дозах 20, 40 мг/кг массы животного ежесуточно и ряда фармакологических препаратов (ацетилцистеин, мексидол, трисан, цитофлавин, глутоксим, литан) в условиях повторной интокси кации ксенобиотиком в дозе 20 мг/кг в течение 10 суток на состояние систе мы глутатиона и ПОЛ в различных тканях белых беспородных крыс.
Фармакологические препараты, используемые для коррекции токсиче ского эффекта повторной интоксикации ЦФ, способны проявлять следую щие фармакотерапевтические эффекты:
- антиоксидантный - индукция синтеза глутатиона (ацетилцистеин);
- антиоксидантный - нейтрализация АФК, продуктов ПОЛ (цитофла вин, мексидол);
- антигипоксический - снижение потребности клеток в кислороде (трисан);
- детоксимодифицирующий - индукция синтеза ферментов детоксикации ксенобиотиков (глутоксим);
- гемостимулирующий - увеличение доступного пула реутилизируемого железа (литан).
Состояние системы глутатиона при повторных введениях ЦФ оцени вали в тканях печени, почек, головного мозга и в эритроцитах лабораторных животных на основе исследования уровня низкомолекулярных (восстанов ленный глутатион) и белковых сульфгидрильных групп, а также активности некоторых ферментов, непосредственно определяющих состояние указанной биохимической системы и сопряженных с ней систем:
1) ферментов, участвующих в восстановлении окисленной формы глута тиона: глутатионредуктазы, а также ключевого фермента пентозофосфатного шунта и основного поставщика кофермента глутатионредуктазной реакции НАДФН - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы;
2) глутатионзависимых антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы и глутатион-8-трансферазы, а также основного синергиста глутатионпероксидазы в реакции обезвреживания перекиси водорода - каталазы;
3) фермента глутатионовой конъюгации - глутатион-S-трансферазы.
Для оценки интенсивности протекания процессов перекисного окисле ния липидов в условиях повторных отравлений ЦФ в исследуемых тканях определяли концентрации первичных и вторичных продуктов ПОЛ ~ диено вых конъюгатов и малонового диальдегида.
Концентрацию восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, продуктов ПОЛ и активность вышеперечисленных ферментов в ис следуемых тканях проводили спектрофотометрическими методами. Выбор этих методов исследования определялся их высокой информативностью и точностью, относительно небольшим количеством необходимого для иссле дования материала, возможностью проведения обследования всех животных одномоментно по всем вышеперечисленным показателям. Важным достоин ством спектрофотометрического метода исследования является то, что он не требует дополнительного специального оборудования и может легко вос производиться в любых клинико-диагностических лабораториях, что позволяет проводить сравнение полученных результатов с данными других авто ров.
Экспериментальные исследования выполнены на 180 белых беспород ных крысах-самцах массой 190-210 г из питомника РАМН «Рапполово». Со держание и использование животных в эксперименте проводилось согласно положениям, изложенным в работе И.П.Западнюка [23]. Животных содержа ли в виварии Военно-медицинской академии в пластмассовых клетках по голов при температуре воздуха 20°-22"С, естественном освещении, на под стилках из опилок деревьев лиственных пород. Рацион животных соответст вовал Приказу МО СССР №245 от 1982 г. и Приказу МЗ №1179 от 1983г.
Кормление осуществлялось ad libitum, в первой половине дня. Для марки ровки животных применяли спиртовой раствор пикриновой кислоты. Сопос тавимость экспериментальных групп обеспечивали рандомизацией выборок, использовавшихся в экспериментах.
Выбор животных для экспериментов определялся следующими факто рами:
1. Крысы являются стандартным объектом в биологических исследованиях.
2. Обладают сопоставимой с другими видами лабораторных животных и че ловеком чувствительностью к действию факторов химической природы и фармакологических препаратов.
3. Относительно низкой стоимостью этих животных.
2.2. Моделирование повторной интоксикации циклофосфаном В ходе экспериментального исследования проводили оценку влияния повторного введения циклофосфана (в течение 1-10 суток) в дозах 20, мг/кг ежесуточно на состояние показателей системы глутатиона и перекисного окисления липидов в различных тканях лабораторных животных в раз личные сроки исследования.
Моделирование повторной интоксикации ЦФ осуществляли согласно схеме гепатотоксического воздействия ЦФ, разработанной и описанной в статье «Фитофармакоррекция лекарственных гепатопатий» проф. Т.А. Ажуновой с соавторами [1].
Забой животных проводили через 1 сутки после введения ЦФ в пере численных дозах в течение 1, 3, 5, 7 и 10 дней.
При проведении фармакологической коррекции цитотоксического действия ЦФ через 30 мин после введения токсиканта в дозе 20 мг/кг живот ным внутрибрюшинно ежедневно вводили один из следующих препаратов в течение 10 суток:
1. Ацетилцистеин в виде 3 % водного раствора в дозе 150 мг/кг массы.
2. Трисан в виде 1 % водного раствора в дозе 15 мг/кг.
3. Цитофлавин в виде 10 % водного раствора в дозе 100 мг/кг.
4. Мексидол в виде 1 % водного раствора в дозе 100 мг/кг.
5. Глутоксим в виде 1% водного раствора в дозе 100 мг/кг.
6. Литан в виде 0,5% водного раствора в дозе 100 мг/кг.
Контрольным животным (интактным) в те же сроки внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в дозе 10 мл/кг массы.
После затравки и введения препаратов коррекции до момента забоя животные опытных групп содержались в тех же условиях, что и животные контрольной группы.
Схема проведения экспериментального исследования представлена в табл. Схема проведения экспериментального исследования группы циклофосфана 2.3. Характеристика использованных фармакологических препаратов Ацетилцистеин - предшественник синтеза глутатиона, производное серосодержащей аминокислоты цистеина, от которой отличается тем, что один водород аминогруппы замещен остатком уксусной кислоты. В клини ческой практике используется в качестве эффективного муколитического средства и гепатопротектора при отравлениях хлорированными углеводоро дами. Являясь предшественником синтеза глутатиона, по сообщениям ряда авторов, может оказывать цитопротекторное действие за счет активации синтеза восстановленного глутатиона в у-глутамилтрансферазном цикле [70]. В эксперименте использовался коммерческий препарат производства «HEXAL PHARMA GmbH», Германия.
Трисан - препарат растительного происхождения, обладающий выра женным антигипоксантным действием. По химической структуре представ ляет собой производное индолморфолина. Препарат способствует более эф фективному сопряжению окисления и фосфорилирования, ему присущи свойства переносчика электронов. У препарата выявлена также и антиоксидантная активность [32,58]. Препарат разработан ООО «Фармако - Трисан»
(Россия), Фармакологическим Комитетом МЗ РФ разрешен к клиническим испытаниям.
Мексидол - синтетический антиоксидант, обладающий выраженными антиоксидантными, антигипоксантными и мембраностабилизирующими свойствами. По химической структуре представляет собой 2-этил-6-метил-3оксипиридина сукцинат. С одной стороны, он имеет сходство с пиридоксином, с другой стороны, в его состав входит субстрат цикла Кребса - сукци нат, который оказывает стимулирующее воздействие на синтез макроэргов митохондриями [12,28]. Выпускается 0 0 0 «Фармасофт» (Россия).
Цитофлавин - комплексный препарат, содержащий сукцинат натрия, рибоксин, рибофлавин, никотинамид. Обладает цитопротекторным, антиги поксантным и антиоксидантным действиями. Оказывает положительный эффект на процессы биоэнергетики клетки, уменьшает продукцию свобод ных радикалов, повышает активность ферментов антиоксидантной защиты.
Препарат активирует окислительно-восстановительные ферменты дыхатель ной цепи митохондрий, стимулирует внутриклеточный синтез белка и нук леиновых кислот, способствует утилизации глюкозы, жирных кислот и ресинтезу макроэргов. Обладает антиишемическим действием, улучшает коро нарный и мозговой кровоток, ограничивает зону некроза и стимулирует репаративные процессы в миокарде. Препарат улучшает метаболические про цессы в ЦНС через у-аминобутиратный шунт нервной ткани (цикл Робертса) и обладает ноотропным действием [28,50]. Производится НТФФ «Полисан»
(Россия).
Глутоксим - бис-у-Ь-глутамил - L-цистеинил-бис-глицин синтетический аналог природного гексапептида - окисленного глутатиона.
Глутоксим обладает иммунокоррегирующей, гемостимулирующей актив ностью, повышает резистентность клеток и организма в целом при локаль ных и генерализованных хронических инфекциях, увеличивает эффектив ность химиотерапии в отношении внутриклеточных инфекций, устраняет проявления неспецифического синдрома хронических заболеваний.
Фармакологическая активность препарата Глутоксим определяется его спо собностью оказывать селективное воздействие на сульфгидрильные (тиоловые) группы поверхностно-клеточных и растворимых рецепторов, что при водит к восстановлению их функционально активной конформации и чув ствительности к регуляторным и транспортным молекулам пептидной при роды [15,72]. Выпускается ГОС НИИ ОЧБ (Санкт-Петербург).
Литан - литиевая соль окисленного глутатиона. Препарат проходит клинические испытания.
2.4. Получение образцов тканей для исследований С целью получения материала для исследований от лабораторных жи вотных производили декапитацию крыс. Полученную кровь стабилизирова ли 4% раствором цитрата натрия в соотношении стабилизатор: кровь 1:6 затем охлаждали и немедленно использовали в исследованиях. Извле ченные после декапитации органы: печень, почки и головной мозг, отмывали холодным физиологическим раствором от крови в течение 35-50 с и замо раживали в жидком азоте. Образцы хранились до момента исследования в сосуде Дюара с жидким азотом.
Перед исследованием ткани печени, почек и головного мозга лабора торных животных извлекали из жидкого азота, взвешивали, измельчали и гомогенизировали в микроизмельчителе тканей РТ-2 (Россия) с пестиковым гомогенизатором при 3000 об./мин, добавляя охлажденный до температуры 0°С 0,1 М калий-фосфатный буфер с рН 7,4 в соотношении ткань:буфер Полученный гомогенат использовали для определения концентрации восстановленного глутатиона, содержания сульфгидрильных групп белков, МДА и ДК. Время от момента размораживания тканей до отбора проб гомогенатов и осаждения в них белка кислотами не превышало 45-60 с.
Для определения активностей ГП, ГР, ГТ, Г-6-Ф-ДГ и каталазы ис пользовали очищенную цитоплазматическую фракцию, которую получали дифференциальным центрифугированием. Гомогенат переносили в пласти ковые стаканчики и центрифугировали в течение 20 мин при +4°С с ускоре нием 20000 g на центрифуге K-24D (Германия). Супернатант рецентрифугировали в течение 60 мин при +2°С при 44500 об./мин (ускорение 150000 g) с использованием ротора Туре 50 3.Ti на ультрацентрифуге L8-M («Beckman», США). Полученный супернатант использовали для определения активности исследуемых ферментов.