5 9 3 минаева любовь валерьевна ^/-/emaci^cl^ эксперртментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения цржлофо

2.5. Определение показателей системы глутатиона и продуктов ПОЛ в эрит­ 2.5.1. Определение концентрации восстановленного глутатиона Концентрацию восстановленного глутатиона в гомогенатах исследуе­ мых тканей и в гемолизате эритроцитов определяли с использованием 5,5'ди-тио-бис(-2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) по методике G.L.Ellman [114] с применением раствора сульфосалициловой кислоты для осаждения белка в пробах, что в отличие от использования метафосфорной или трихлоруксусной кислот исключало спонтанный переход восстановленной формы глутатиона в окисленную.

Принцип метода основан на образовании при взаимодействии ДТНБ (реактива Эллмана) с кислоторастворимыми тиоловыми группами окрашен­ ного продукта - 5-тио,2-нитробензойной кислоты (ТНБ), имеющего макси­ мум поглощения на длине волны 412 нм.

К 0,6 мл гомогената тканей или гемолизата эритроцитов добавляли 0,2мл 20 % раствора сульфосалициловой кислоты. Пробы центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин при температуре +2°С. 0,2 мл полученно­ го супернатанта переносили в пробирки, содержащие 2,55 мл 0.1 М ТРИСНС1 буфера с 0,01 % этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) рН 8,5. К полу­ ченной смеси добавляли 25 мкл раствора ДТНБ (4 мг коммерческого препа­ рата ДТНБ («Boehringer Mannheim», Германия) в 1 мл абсолютного метано­ ла). После развития окраски пробы фотометрировали на спектрофотометре DU 650 («Вескшап»,США) против дистиллированной воды на длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Расчет содержания вос­ становленного глутатиона проводили по калибровочной кривой. Для чего из коммерческого препарата ВГ («Sigma», США) готовили растворы ВГ с кон­ центрациями от 0,02 до 2,0 ммоль/л, из них отбирали пробы для определения содержания восстановленного глутатиона по описанной выше методике и по полученным значениям экстинкции строили калибровочную кривую. По ка­ либровочной кривой рассчитывали концентрацию восстановленного глутатиона и выражали в мкмоль/г ткани или мкмоль/г гемоглобина.

2.5.2. Определение концентрации сульфгидрильных групп белков Содержание сульфгидрильных групп белков в тканях печени, почек, головного мозга и в эритроцитах производили по методу G.Bellomo [83].

Принцип метода заключается в первоначальном осаждении белков раствором хлорной кислоты с последующей их солюбилизацией и взаимо­ действием сульфгидрильных групп с реактивом Эллмана.

К 100 мкл гемолизата эритроцитов (соотношение эритроцитарная взвесь/5 мМ ТРИС-НС1 буфер с рН 7,6 - 1:219) или 100 мкл гомогената го­ ловного мозга добавляли 100 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера рН 7,4;

гомогенат печени и почек брали в объеме 50 мкл, к нему добавляли соответ­ ственно 150 мкл буфера. После этого для осаждения белка в полученные пробы вносили 200 мкл 10 % хлорной кислоты. Пробы центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин. Супернатант удаляли, осадок дважды центрифугировали и отмывали от хлорной кислоты и других низкомолекулярных соединений 1 мл дистиллированной воды. Осадок солюбилизировали в 5 мл 0,5 М ТРИС-НС1 буфера с рН 8,8, содержащего мМ ЭДТА и 1% раствор додецил-сульфата натрия. К 2 мл солюбилизата добавляли 25 мкл раствора реактива Эллмана (4 мг коммерческого препарата ДТНБ («Boeliringer Mannheim», Германия) в 1 мл абсолютного метанола).

После развития окрашивания пробы фотометрировали на спектрофотометре DU 650 против солюбилизата без ДТНБ на длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Для построения калибровочной кривой, используемой для расчета содержания свободных сульфгидрильных групп белков, применяли тиолсодержащее соединение с известной молекулярной массой - восстановленный глутатион. Методика получения кривой описана выше. По соответствующей калибровочной кривой рассчитывали содержа­ ние свободных сульфгидрильных групп белков в гомогенатах тканей и в эритроцитах и выражали в мкмоль/г ткани или мкмоль/г гемоглобина.

2.5.3. Определение активности глутатионпероксидазы Активность глутатионпероксидазы определяли по методу А.Р.Гавриловой [14] с использованием в качестве субстрата гидроперекиси трет-бутила (ГПТБ).

Принцип метода заключается в утилизации восстановленного глутатиона ГП при инкубации цитозоля клеток или гемолизата эритроцитарной взвеси с ГПТБ. Содержание ВГ в пробах до и после инкубации определяли в цветной реакции с ДТНБ, описанной выше.

Для осуществления ферментативной реакции цитозольную фракцию дополнительно разводили 0,1 М калий-фосфатным буфером с рН 7,4 печени в 40 раз, почек в 20 раз, мозга в 2 раза. Гемолизат эритроцитов дополнитель­ но разводили 5 мМ трис-НС1 буфером с рН 7,4 в соотношении 1:219. В опытную и контрольную пробы вносили 0,2 мл разведенного цитозоля или гемолизата добавляли 0,73 мл сложного 0,1 М ТРИС-НС1 буфера рН 8,5 (в мл буфера содержалось 0,1 мг ЭДТА, 0,78 мг NaN^ («Sigma», США) и 1 мг ВГ («Sigma», США) и инкубировали в термостате при +37°С в течение мин. Реакцию запускали внесением 70 мкл раствора ГПТБ, приготовленного разведением 70 % коммерческого препарата ("ICN", США) в дистиллиро­ ванной воде в 500 раз. В контрольные пробы вместо раствора ГПТБ вносили 70 мкл НгО. После инкубации в течение 5 мин при +37°С реакцию останав­ ливали внесением в пробирки по 0,2 мл 20% раствора трихлоруксусной ки­ слоты. Пробы центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 мин, супернатант использовали для определения количества восстановленного глутатиона аналогично вышеописанной методике. Расчет активности фермента производили no калибровочной кривой на основании разницы количества ВГ в опытной и контрольной пробах и выражали в ммоль/(минт белка) или мкмоль/(минт гемоглобина) (для эритроцитов).

2.5.4. Определение активности глутатионредуктазы Активность глутатионредуктазы определяли методом I.Carlberg и B.Maimervik [94].

Принцип метода основан на каталитической НАДФН-зависимой реак­ ции восстановления окисленной формы глутатиона в восстановленную, ин­ тенсивность которой может быть оценена по скорости снижения экстинкции проб на длине волны 340 нм, на которой раствор НАДФН имеет максимум светопогл ощения:

Для осуществления ферментативной реакции цитозольную фракцию дополнительно разводили 0,1 М калий-фосфатным буфером рН 7,4 в соот­ ношении: для почек и печени - 1:9, для мозга использовали исходную фрак­ цию. Гемолизат эритроцитов дополнительно разводили 5 мМ ТРИС-НС1 бу­ фером с рН 7,4 в соотношении 1:9. Реакцию проводили в кювете при темпе­ ратуре +37°С на водяной бане. В кювету вносили 1,8 мл 0,1 М калийфосфатного буфера рН 7,0 с 1 мМ ЭДТА, 0,1 мл 20 мМ водного раствора окисленного глутатиона («Boehringer Mannheim», Германия) и 100 мкл ис­ ходной или разведенной цитозольной фракции или гемолизата. После 3 - мин уравновешивания температур запускали реакцию добавлением 0,1 мл 2мМ раствора НАДФ-Н («F.Hoffmann - La Roche», Швейцария), растворен­ ного в 10 мМ ТРИС-НС1 буфере с рН 7,0. Измерение оптической плотности исследуемых растворов проводили на длине волны 340 нм против воды сра­ зу же после перемешивания содержимого и через 5 мин в кювете с длиной оптического пути 10 мм в спектрофотометре СФ-26. В качестве контроля использовали измерение оптической плотности реакционной смеси, в кото­ рую вместо цитозоля вносили в том же объеме 0,1 М калий-фосфатный бу­ фер с рН 7,4. Расчет активности глутатион-редуктазы осуществляли согласно закону Бугера-Ламберта-Бэра, используя молярный коэффициент светопоглощения для НАДФН на длине волны 340 нм, равный Е = 6 2 0 0 М ' - С М '. Ак­ тивность выражали в мкмоль/(минт белка) или мкмоль/(минт гемоглобина) (для эритроцитов).

2.5.5. Определение активности глутатион-8-трансферазы Определение активности глутатион-8-трансферазы проводили по ме­ тоду W.H.Habig и W.B.Jakoby [118].

Принцип метода основан на взаимодействии восстановленного глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом в присутствии глутатион-Sтрансферазы с образованием продукта, имеющего максимум светопоглощения при длине волны 340 нм.

Для осуществления ферментативной реакции цитозольную фракцию дополнительно разводили 0,1 М калий-фосфатным буфером с рН 7,4 в соот­ ношении: для печени и почек - 1:9, для мозга использовали исходную фрак­ цию. Гемолизат эритроцитов дополнительно разводили 5 мМ трис-НС1 бу­ фером с рН 7,4 в соотношении 1:1. Реакцию осуществляли в кювете при температуре +37°С на водяной бане. В кювету вносили 1,2 мл 2 мМ раствора восстановленного глутатиона («Sigma», США) на 0,1 М калий-фосфатном буфере с рН 6,5 и 0,1 мл разведенной цитозольной фракции. После уравно­ вешивания температур реакцию запускали внесением в среду 1,2 мл 2 мМ раствора 1-хлор-2,4-динитробензола (10 мг коммерческого препарата («ICN», США) растворяли в 1 мл абсолютного метанола, а затем к получен­ ному спиртовому раствору добавляли 23 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера с рН 6,5). Измерение оптической плотности исследуемых растворов прово­ дили на длине волны 340 нм против воды сразу после перемешивания со­ держимого и через 5 мин в кювете с длиной оптического пути 10 мм в спек­ трофотометре DU 650. В качестве контроля использовали измерение оптиче­ ской плотности смеси, куда вместо цитозоля вносили такой же объем 0,1 М калий-фосфатного буфера с рН 7,4. Расчет активности глутатион S-трансферазы осуществляли согласно закону Бугера-Ламберта-Бэра, с использова­ нием молярного коэффициента светопоглощения для образующегося продукта на длине волны 340 нм, равного s=9600 М" см". Активность выражали в мкмоль/(минг белка) или мкмоль/(минт гемоглобина) (для эритроцитов).

2.5.6. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли по методу A.Komberg и соавт. [126].

Принцип метода основан на ферментативной реакции переноса прото­ нов с глюкозо-6-фосфата на НАДФ^ под воздействием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, при этом образуется НАДФ-Н, водные растворы которого имеют максимум светопоглощения на длине волны 340 нм. По интенсивно­ сти роста экстинкции при спектрофотометрии на указанной длине волны су­ дят об активности фермента:

Глюкозо-6-фосфат + НАДФ^ - 6-Ф-глюконат + НАДФН + Н^ Ферментативную реакцию проводили на водяной бане при температу­ ре при +37''С. В кювету вносили 3,0 мл 50 мМ ТРИС-НС1 буфера рН 7,6 с 5 мМ ЭДТА, 0,1 мл 10 мМ раствора НАДФ («Merck», Германия) и 50 мкл цитозольной фракции печени, почек или гемолизата эритроцитов, либо мкл цитозольной фракции мозга. После уравновешивания температур реакцию инициировали добавлением к исследуемой среде О, I мл 5 мМ раствора глюкозо-6-фосфата натрия («Boehringer Mannheim», Германия). Пробы фотометрировали на длине волны 340 нм против дистиллированной воды сразу после перемешивания содержимого и через 5 мин в кювете с длиной оптиче­ ского пути 10 мм на спектрофотометре DU 650. Расчет активности проводи­ ли по разности экстинций согласно закону Бугера-Ламберта-Бэра, используя молярный коэффициент светопоглощения для образующегося НАДФН на длине волны 340 нм, равный е=6200 М"^см"'. Активность выражали в мкмоль/(минт белка) или мкмоль/(минт гемоглобина) (для эритроцитов).

2.5.7. Определение активности каталазы Активность каталазы определяли методом М.А.Королюка [39]. Прин­ цип метода основан на ферментативном разложении каталазой перекиси во­ дорода, о скорости процесса судят по снижению экстинкции проб на длине волны 260 нм, на которой раствор Н2О2 имеет максимум светопоглощения.