WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 17 |

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

-- [ Страница 1 ] --

Учреждение Российской академии наук

Институт химической

кинетики и горения Сибирского отделения РАН

На правах рукописи

Орлова Дарья Юрьевна

КИНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ И

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ И ЛАЗЕРНОЙ

СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОСКОПИИ

Специальность 03.01.02 – биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук.

Научный руководитель доктор физико-математических наук Мальцев В.П.

Новосибирск – Содержание Введение

Глава 1 Обзор литературы

1.1. “Лиганд” и “рецептор”. Типы клеточных рецепторов

1.2. Характеристика нейтрофилов. Поверхностные рецепторы

1.3. Экспериментальные методы исследования взаимодействия лиганд – рецептор на поверхности живых клеток

1.4. Ядро – динамичная среда

1.5. Структура хроматина. Краткое описание

1.6. Белок гетерохроматина HP1

1.7. Экспериментальные методы исследования взаимодействия лиганд-рецептор внутри живых клеток

Глава 2 Материалы и методы

2.1. Сканирующий проточный цитометр

2.2. Пробоподготовка нейтрофилов для измерения на СПЦ

2.3. Проточный цитометр FACS Calibur

2.4. Постановка кинетического эксперимента по исследованию поверхностных лиганд-рецепторных взаимодействий

2.5. Основные компоненты конфокального микроскопа Leica TCS SP5.............. 2.6. Постановка кинетического эксперимента по исследованию внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий

2.6.1. Плазмиды

2.6.2. Клеточные культуры и трансфекция

2.6.3. Тестовый раствор

2.6.4. FRAP-протокол

Глава 3 Исследование поверхностных лиганд-рецепторных взаимодействий

3.1. Теория

3.1.1 Формулировка физической модели

3.1.2. Кинетическая схема процесса лиганд-рецепторного связывания............... 3.1.3. Приближение непрерывной функции распределения

3.1.4. Зависимость констант скоростей реакции от количества посадочных мест

3.1.5. Распределение клеток по количеству занятых рецепторов

3.2. Результаты

3.2.1. Определение абсолютного дифференциального сечения светорассеяния нейтрофила

3.2.1.1. Чувствительность и разрешающая способность СПЦ

3.2.1.2. Оптическая модель и дифференциальное сечение рассеяния нейтрофила 3.2.2. Чувствительность проточного цитометра FACS Calibur

3.2.3. Исследование кинетики лиганд – рецепторного взаимодействия на мембранах нейтрофилов

3.2.4. Определение размера сайта связывания для 1D3 IgM моноклональных антител на FcRIIIb рецепторе

3.3. Обсуждение результатов

Глава 4 Исследование внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий

4.1. Метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания .............. 4.1.1. Общая формулировка

4.1.2. Кинетическая схема процесса

4.2. Результаты

4.2.1. Разработка нового FRAP метода для неоднородных сред

4.2.2. Апробация метода на простых системах

4.2.2.1. Проверка метода на примере ядер живых клеток

4.2.2.2. Проверка метода на FITC-HSА в растворе глицерин/вода

4.2.2.3. Проверка метода на GFP-HP1 в ядрах живых клеток, используя различные позиции области фотовыжигания

4.2.2.4. Проверка метода на GFP-HP1 в ядрах живых клеток, используя различные размеры области фотовыжигания

4.2.3. Исследование мобильности гетерохроматиновых белков

4.3. Обсуждение результатов

Заключение

Выводы

Приложение

Описание сокращений и обозначений

Литература

Введение Актуальность. Исследование мембранных и внутриклеточных лигандрецепторных взаимодействий представляет собой одно из основных направлений развития современной иммунологии, клеточной и молекулярной биологии, а также представляет интерес для биофизики в целом.

В настоящее время изучение защитной реакции организма на инфекции (бактериальные, вирусные, грибковые или паразитарные) становится всё более актуальным. Любая макромолекула, чуждая организму, может вызвать защитную реакцию - иммунный ответ. Взаимодействие типа лиганд-рецептор играет ключевую роль в иммунитете, являясь основой распознавания “свой-чужой” на молекулярном и клеточном уровне. Такой тип взаимодействия важен для различных биологических процессов. Например, передача сигналов от окружающей среды клетки в ее внутреннюю часть происходит путём лиганд-рецепотрного взаимодействия белков с сигнальными молекулами. Это играет фундаментальную роль во многих биологических процессах и во многих болезнях (например, таких как рак).

Известно, что все биологические молекулы в клетке – нуклеиновые кислоты, белки и т.д. – синтезируются в строго определенных местах и затем перемещаются к «месту назначения», где они должны выполнить свою специфическую функцию.

Перенос макромолекул зачастую происходит за счет диффузии. Однако в сильно неоднородных средах (например, клеточное ядро) процесс диффузии может значительно усложняться наличием обратимого лиганд-рецепторного взаимодействия макромолекул с сайтами связывания. Поэтому для исследований мобильности белков важно совместно рассматривать оба процесса: диффузию и обратимое лиганд – рецепторное взаимодействие.

В последние годы с разработкой новых экспериментальных методов (таких как, иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ, иммуноагглютинация, проточная цитометрия и т.д.) появляется все больше экспериментальных работ, посвященных исследованию мобильности белков и кинетики взаимодействий типа лиганд-рецептор. Проточная цитометрия выгодно отличается от других методов, так как позволяет исследовать кинетику связывания лиганда с рецептором на поверхности одиночных клеток. Для исследований лиганд-рецепторного взаимодействия внутри живых клеток наиболее широко применяются метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания и количественная флуоресцентная лазерная конфокальная сканирующая микроскопия. Однако, для количественных кинетических исследований белковых взаимодействий типа лиганд-рецептор в сильно неоднородных средах (например, в ядрах клеток) эти методы не были развиты.

Актуальность данной работы определяется методами и объектами исследования.

С одной стороны, существует проблема повышения информативности кинетических измерений биологических процессов на поверхности клеток с помощью проточной цитометрии. Такая проблема решается в данной работе развитием методической базы, основанной на технологии проточной цитометрии с измерением динамики функций распределений. Объектом исследования в данном случае являются специфические обратимые лиганд-рецепторные реакции. Важность исследований жизнедеятельности биологического организма.

количественных параметров (коэффициент диффузии, константы скорости ассоциации и диссоциации) динамики молекул в среде с неоднородным распределением связывающих центров (например, ядро живой клетки) методом восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (Fluorescence recovery after photobleaching FRAP). Такая проблема решается в данной работе созданием метода для анализа кинетики восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания для сильно неоднородных сред с оценкой количественных параметров динамики молекул.

Объектом исследования являются белки, вовлеченные в процессы транскрипции и трансляции, формирование и поддержание конденсированного хроматина и стабильности генома, а также участвующие в репарации двухцепочечных разрывов ДНК. А именно, в рамках данной работы исследована динамика гетерохроматиновых белков HP1, HP1, HP1.

Исследовать поверхностные и внутриклеточные лиганд-рецепторные взаимодействия с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии на нейтрофилах человека и в фибробластах мышиных эмбрионов, соответственно.

1. Усовершенствовать методику исследования связывания растворенных лигандов с математическую модель, учитывающую гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов.

2. С использованием усовершенствованной методики охарактеризовать нейтрофилы человека по количеству поверхностных рецепторов FcRb и по скоростям прямой и обратной реакций «лиганд-клеточный рецептор».

3. С использованием метода сканирующей проточной цитометрии исследовать светорассеивающие свойства нейтрофилов человека, а именно: измерить зависимость дифференциального сечения рассеяния от угла рассеяния.

4. Разработать метод анализа кинетики восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания для сильно неоднородных сред с оценкой количественных параметров динамики белков в ядрах живых клеток.

5. Исследовать диффузию гетерохроматиновых негистоновых белков семейства HP в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов и кинетику реакции их взаимодействия с три-метилированным гистоновым белком H3.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Усовершенствованная методика исследования связывания растворенных лигандов с низкоаффинными поверхностными рецепторами клетки, учитывающая гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов, позволяет оценивать значения констант скорости прямой и обратной реакций лиганд-рецепторного взаимодействия, а также определять абсолютное распределение рецепторов в клеточной популяции.

2. Значения констант скорости ассоциации и диссоциации одиночной лигандрецепторной пары «1D3 IgM – FcRIIIb» равны k+=(7.5±1.0)10-16 см3/c и kc, соответственно. Среднее количество поверхностных рецепторов FcRb на нейтрофилах человека варьируется от пациента к пациенту от 0.5105 до 3105.

3. Константа эффективной диффузии молекул лигандов в среде с неоднородным распределением сайтов связывания (рецепторов) может быть определена без нахождения полного решения исходной системы дифференциальных реакционнодиффузионных уравнений.

4. Средние значения констант эффективной диффузии белка HP1 в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов Suv39h1/2+/+ и Suv39h1/2-/- равны (5.7 ± 0.8) 10- см2/с и (4.9 ± 0.4) 10-8 см2/с, соответственно. После обработки клеток трихостатином A, вызывающим ацетилирование гистонов на всем протяжении геномной ДНК, среднее значение константы эффективной диффузии белка HP1 в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов Suv39h1/2+/+ и Suv39h1/2-/- равно (3.9 ± 0.6)·10-8 см2/с и (3.4 ± 0.3)·10-8 см2/с, соответственно.

Практическая и теоретическая ценность. Проведенная работа позволила развить потенциал метода проточной цитометрии для исследования поверхностных обратимых лиганд-рецепторных взаимодействий и метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания для сильно неоднородных сред.

Практическая ценность настоящей работы определяется использованием полученных результатов:

- для иммунологического анализа клеток;

- в исследовании внутриклеточных процессов;

- при разработке новых лекарственных препаратов.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения РАН совместно с Институтом биофизики Чешской академии наук и Институтом клинической иммунологии СО РАМН.



Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 17 |
 


Похожие материалы:

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.