WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 17 |

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

-- [ Страница 10 ] --

Величина фона составляла около 10% от максимального пика сигнала светорассеяния, что для оценки можно взять равной nb=0.1·(1.3·106) (Рис. 18). Так как стандартное отклонение есть мера разброса значений относительно среднего, то, приравняв p =1, найдем величину сигнала светорассеяния nf, при котором шумы сравнимы с данным сигналом. Решая квадратное уравнение (35) относительно неизвестной nf, получим значение nf = 1.6 103. По чувствительности ФЭУ нет ограничений, так как нет угла, соответствующего полученному значению nf, (Рис. 18). Таким образом, диапазон углов, нейтрофила, ограничивается значением 120 градусов.

3.2.1.2. Оптическая модель и дифференциальное сечение рассеяния нейтрофила СПЦ позволяет измерять абсолютные характеристики светорассеяния частиц.

Индикатрисы светорассеяния полистирольных частиц, измеренные на СПЦ, хорошо согласуются с индикатрисами, посчитанными с помощью теории Ми [177], поэтому размер и показатель преломления однородных сферических частиц были определены методом наименьших квадратов (МНК).

Дифференциальное сечение рассеяния вычислялось по формуле:

Где S11-сигнал с СПЦ, -дифференциальное сечение рассеяния, n0=1. показатель преломления среды, = 660 нм – длина волны излучаемого лазера.

Дифференциальное сечение рассеяния характеризует эффективность частицы рассеивать свет. Для определения дифференциального сечения нейтрофилов на СПЦ одновременно измерялись индикатрисы полистирольных частиц (сферы) размером 5мкм и лейкоцитов четырёх различных пациентов. Пробоподготовка осуществлялась Дифференц. сечение рассеяния, см Рис. 19 Дифференциальное сечение нейтрофилов и полистирольных частиц по описанной выше методике. По флуоресценции были выделены индикатрисы нейтрофилов. Результаты измерения представлены на Рис. 19. Шкала абсолютного дифференциального сечения рассеяния была определена с помощью метода нелинейной регрессии экспериментальных индикатрис полистирольных частиц и Таблица 3. Средние значения размеров нейтрофилов со стандартной ошибкой среднего и шириной распределения.

теоретических индикатрис, посчитанных с помощью теории Ми.

В данной Таблице 3 представлены средние значения размеров нейтрофилов со стандартной ошибкой среднего и шириной распределения. Размер клеток определялся с помощью Фурье преобразования индикатрисы [178]. Посчитано для четырёх различных пациентов.

На Рис. 20 представлены средние дифференциальные сечения рассеяния нейтрофилов для четырёх различных пациентов. Так как размеры самих клеток и гранул отличаются от пациента к пациенту, это обуславливает различия между Рис. 20 Среднее (по пробе) дифференциальное сечение рассеяния нейтрофилов четырёх различных пациентов дифференциальными сечениями рассеяния.

производится относительно легко [179]. К сожалению, большинство клеток крови имеют неоднородную структуру и сложную форму. Поэтому была предложена оптическая модель нейтрофила в виде сферы, заполненной сферами меньшего диаметра - гранулами и ядром в виде четырёх сфероидов различных размеров (Рис. 20). Данная модель имеет следующий набор параметров, значения которых соответствуют литературным данным по морфологии [180]: диаметр клетки dс=9.6 мкм (Таблица 3), диаметр гранул dg=0.1, 0.15 и 0.2 мкм [181,182], показатель преломления цитоплазмы клетки mc=1.357, показатель преломления гранул mg=1.54, показатель преломления среды (в данной работе это физ. раствор) m0=1.337 [183,184], объёмная доля гранул f=0.1, 0.2 [185], объёмная доля ядра – 0.11 [186].

Рис. 21 Оптическая модель нейтрофила. Все гранулы идентичны и расположены случайным образом. Доли ядра отличаются друг от друга по размеру и расположены случайным образом.

Данная модель была использована для расчёта дифференциального сечения рассеяния методом Discrete Dipole Approximation (DDA) [179]. В настоящее время DDA самый мощный метод расчёта светорассеяния от биологических частиц произвольной формы.

Расчёт методом DDA был произведён для шести различных наборов параметров (Таблица 4). Варьировали диаметр гранул dg и угол поворота клетки относительно оси Таблица 4. Набор параметров оптической модели нейтрофила, использованный для расчета светорассеяния методом DDA.

Результаты расчёта представлены на Рис. 21. Анализ теоретических индикатрис нейтрофилов для различных наборов параметров позволяет сделать заключение, что Дифференц.сечениерассеяния, см Рис. 22 Дифференциальное сечение рассеяния оптической модели нейтрофилов для различных наборов параметров (слева). Дифференциальное сечение рассеяния для характерных нейтрофилов четырёх различных пациентов (справа).

интенсивность рассеянного света в углы более 30, зависит от размера гранул и их количества. Абсолютные сечения рассеяния модели нейтрофила (Рис. 22, слева) и экспериментально измеренных клеток (Рис. 22, справа) демонстрируют хорошее согласие, что позволяет сделать вывод об адекватности, предложенной нами оптической модели нейтрофила.

Впервые эффективность рассеивать свет нейтрофилами исследовалась двумя наиболее современными методами анализа одиночных частиц, а именно, с помощью сканирующей проточной цитометрии и метода дискретных диполей.

Впервые было измерено сечение рассеяния нейтрофила, что позволило приступить к созданию оптической модели клетки. Предложена оптическая модель нейтрофила, использованная для расчёта абсолютного дифференциального сечения рассеяния методом дискретных диполей.

Следует отметить потенциал сканирующей проточной цитометрии в диагностике связанных с нейтрофилами патологий. Усредненные индикатрисы четырёх пациентов продемонстрировали заметные отличия, что может говорить о наличии тех или иных отклонений. В данном направлении планируется исследование в кооперации с клинической лабораторией медицинского учреждения. Использование сканирующей проточной цитометрии открывает новый способ определения гематологических нейтрофилов.

3.2.2. Чувствительность проточного цитометра FACS Calibur Рассчитаем минимальное количество молекул красителя на частице, которое флуоресценции, будет отличен от шума.

Пусть np – количество фотонов, испускаемых лазером в единицу времени, P мощность лазера, тогда:

Где - длина волны лазера 488нм, Р=15мВт=15·10-3Дж/с.

Поток фотонов через единицу площади при радиусе луча R=10 мкм в области фокуса:

Допустим, на частице находится N молекул красителя (FITC), тогда количество поглощённых фотонов:

N abs = N Где - сечение поглощения молекулы красителя (10-20м2·молекул-1), t- время сбора сигнала (4·10-6с), - время жизни возбуждённого красителя (4.5·10-9c).

Количество флуоресцирующих фотонов, испущенных молекулами красителя и достигших фотоприёмника:

Ns = N Где -квантовый выход флуоресценции (0.85), - телесный угол в котором собирается сигнал.

Где A- числовая апертура (1.2).

Чтобы сигнал был отличен от шума, Ns должно соответствовать как минимум Следовательно, минимальное количество молекул FITC, которое должно быть на частице равно 480.

3.2.3. Исследование кинетики лиганд – рецепторного взаимодействия на мембранах нейтрофилов Традиционным представлением результатов измерения большого количества одиночных клеток на проточном цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) является цитограмма клеточной популяции по флуоресценции и светорассеянию. На Рис. 23 приведены такие экспериментальные цитограммы, полученные в разные моменты времени после смешивания лейкоцитарной взвеси c FITC-мечеными моноклональными антителами к CD16b. Выделенная область (Neutro) соответствует нейтрофилам. На Рис. 24 приведены экспериментальные гистограммы флуоресценции, полученные в разные моменты времени, и непрерывные кривые, показывающие результаты нелинейной регрессии теоретической формулы (21) к экспериментальным данным.

Из рисунка видно, что с течением времени распределение сдвигается вправо, в сторону большей флуоресценции, при этом оно уширяется. Это объясняется тем, что со временем происходит увеличение количества комплексов антиген-антитело на поверхности клеток, что и отражается в виде роста средней интенсивности флуоресценции.

SSC-H Рис. 23. Цитограммы клеточной популяции по флуоресценции и светорассеянию (А)через 0.16 мин, (Б)-через 1 мин после добавления IgM FITC-меченых антител к СD16b.

По осям отложены: FL1-H – интенсивность флуоресценции клетки, SSC-H – интенсивность рассеяния клетки под 90°. Каждая точка соответствует одной клетке.

Кинетика изменения средней флуоресценции клеток представлена на Рис. 25, каждая точка – это усреднение по ~3000 клеткам. Точки отражают экспериментальные значения, а кривые - результаты наилучшей подгонки теоретической кинетики среднего числа занятых рецепторов, определяемой уравнением (25), к экспериментальным результатам.

Из обработки данных по всем пациентам (одновременно для всех пациентов при трёх разных концентрациях антител) были определены константа скорости ассоциации и аффинность (обратная константа равновесия), среднее число рецепторов на нейтрофиле для каждого пациента. Для наглядности результаты нелинейной регрессии приведены на примере одного из пациентов на Рис. 25.

На Рис. 26 приведены результаты сравнения экспериментальных данных с теоретическим уравнением для одной из используемых концентраций антител (A0=1.1·1013см-3).

Рис. 24 Динамика распределения нейтрофилов по количеству занятых рецепторов.

Для описания экспериментальных результатов использовалась математическая модель, описанная в разделе 3.1. Применение этой модели позволяет находить исходную функцию распределения клеточной популяции по количеству рецепторов. На Рис. 27 представлены функции распределения нейтрофилов по полному числу рецепторов для четырёх пациентов. Среднее число рецепторов на нейтрофиле отличается от пациента к пациенту, что может быть использовано как диагностический параметр при анализе крови (при разработке соответствующей методики).

Кроме распределения по количеству рецепторов, из процедуры нелинейной регрессии могут быть извлечены и другие параметры реакции. В Таблице 5 приведены значения параметров полученные из регрессии: константы скорости, среднее число рецепторов на клетке, относительная дисперсия распределения и коэффициент асимметрии. Из приведенных данных можно оценить константу равновесия (обратная Интенсивность флуоресценции Рис. 25. Кинетика средней флуоресценции нейтрофилов одного из пациентов.

аффинность) как отношение констант скоростей прямой и обратной реакции:

K = (4.7 ± 1.3) 10 9 моль/л.

Таблица 5 Результаты теоретической обработки экспериментальных данных Интенсивность флуоресценции Рис. 26. Кинетика средней флуоресценции разных пациентов при одинаковой концентрации антител Рис. 27. Распределение нейтрофилов по полному числу рецепторов для разных пациентов. Для каждого пациента гистограмма нормирована на одно и тоже количество нейтрофилов.

Используя полученное обратное значение константы равновесия, можно рассчитать аффинность K-1= (2.1±0.3) 108 M-1. Полученные средние значения числа рецепторов FcRIIIb на нейтрофилах и значение аффинности рецептора для 1D3 IgM моноклональных хорошо согласуются с опубликованными ранее данными [187].

Полученное значение константы скорости ассоциации примерно в 10 раз меньше по сравнению с опубликованным значением для взаимодействия пептид – рецептор на нейтрофиле [188]. Это является разумным, принимая во внимание разницу в размерах (и, следовательно, в коэффициентах диффузии) между пептидом (N-CHO-Nle-Leu-PheNle-Tyr-Lys, [188]) и моноклональным фнтителом IgM (молярная масса 900 кДальтон).

Значение константы скорости диссоциации, посчитанное с использованием значений константы равновесия и константы скорости ассоциации, k-=(1.3±0.4) 10-1 мин-1, очень близко к значениям констант скорости диссоциации для комплексов:

поверхностный рецептор нейтрофила – IgG моноклональное антитело [189] и поверхностный рецептор нейтрофила – некоторые пептиды [188].



Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 17 |
 


Похожие материалы:

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.