WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 9 | 10 || 12 | 13 |   ...   | 17 |

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

-- [ Страница 11 ] --

Таким образом, развитие разработанной ранее математической модели лигандрецепторного связывания, учитывающей функцию распределения клеток по количеству рецепторов, позволяет определить константы скорости прямой и обратной реакций, константу равновесия, а также количество рецепторов на клетках.

3.2.4. Определение размера сайта связывания для 1D3 IgM моноклональных антител на FcRIIIb рецепторе Используя значение константы скорости ассоциации можно рассчитать радиус сайта связывания (в приближении сферическая форма сайта связывания на клетке сферической формы) (190,191), следующим образом где f a = здесь: R - радиус клетки, D - коэффициент диффузии молекулы лиганда, b радиус сайта связывания, a гидродинамический радиус молекулы лиганда, fc и fa – стерические факторы для поверхности клетки и сайта связывания сответственно, kD – предельная константа скорости реакции ассоциации.

Рис. 28 (взято из [192]). Структурные модели IgM и IgG. IgG является мономером;

IgM представляет собой пентамер, состоящий из пяти мономеров, гомологичных IgG, и J-цепи. Каждый Fab-фрагмент имеет одну точку связывания. Фрагмент Fc (”ножка” Yобразной структуры) не имеет антигенно-активных точек, но, тем не менее, с ним в определенной мере связана биологическая активность молекулы, включая способность активировать комплемент и связываться с рецепторами макрофагов. Молекула IgM имеет 10 точек связывания (25).

Полагаем, что в уравнениях (45) и (46) сайты связывания на рецепторе и на молекуле лиганда имеют одинаковые размеры. Фактор 10 в уравнении (46) для стерического фактора возникает исходя из соображений о структуре моноклонального антитела IgM, имеющего 10 сайтов связывания (Рис. 28). Для того, чтобы проверить условие Nk + k D, мы вычислили коэффициент диффузии молекулы лиганда, используя известное соотношение [193] между коэффициентом диффузии (в см3с-1) и молярной массой (в Дальтонах), M, белка Из чего следует, что при значении M=900,000 Дальтон, D = 3.12 10-7 см2с-1. Затем, полагая для нейтрофила человека R = 5 мкм, значение kD = 7.1 1013 M-1мин-1, что в раз больше, чем произведение Nk + при N =2.5 105. Таким образом, наши экспериментальные данные удовлетворяют условию (43). Коэффициент диффузии можно выразить, используя соотношение Стокса-Эйнштейна [194]:

где k – постоянная Больцмана, T - температура, – динамическая вязкость среды.

Используя уравнения (43)-(48), следующее выражение может быть получено для оценки радиуса сайта связывания:

Подставляя известные параметры и константы в уравнение (49), мы получили размер (диаметр) сайта связывания около 1 нм. Полученный размер сайта связывания хорошо согласуется с опубликованными данными [195] по рентгеноструктурному анализу иммуноглобулина: типичный сайт связывания выглядит как углубление (0.5-1 нм), 1.5нм длиной, и примерно 1 нм шириной.

3.3. Обсуждение результатов Рассмотрение кинетических данных для лиганд – рецепторного взаимодействия, полученных с помощью проточного цитометра, с точки зрения временной эволюции распределения клеток по интенсивности флуоресценции даёт возможность получить подробную информацию о распределении клеточной популяции по числу поверхностных рецепторов, а также о константах скорости ассоциации и диссоциации на единичном рецепторе.

Как показано в Таблице 5 среднее количество поверхностных рецепторов на нейтрофилах варьируется от пациента к пациенту (от 0.5 105 до 3 105), также как и асимметрия распределений по числу рецепторов (от 0.5(±0.2) до 0.3(±0.1)). В то время как коэффициент вариации (т.е. отношение стандартного отклонения к среднему значению) меняется в довольно узком диапазоне (от 0.20(±0.1) до 0.27(±0.1)). Это приводит к мысли о том, что потенциально асимметрия распределения может быть более чувствительным диагностическим параметром, нежели коэффициент вариации.

Возможно, что в скором будущем эти параметры будут добавлены в список стандартных диагностических параметров.

В данной работе теоретически и экспериментально показано, что когда вклад процессов мобильности поверхностных рецепторов (таких как диффузия по поверхности, перекрёстное взаимодействие и т.д.) рецепторов является незначительным, распределение клеток по флуоресценции меняется самоподобным образом (масштабированием по оси абцисс). В принципе, отклонение функции распределения по флуоресценции от самоподобного поведения может указывать как раз на наличие таких процессов.

Таким образом, результаты, приведенные в настоящей главе, позволяют установить границы возможности в характеризации нейтрофилов с помощью проточной цитометрии. Следующие характеристики популяции нейтрофилов могут быть измерены: среднее значение размера нейтрофилов, степень вариации нейтрофилов по размеру, среднее количество рецепторов на мембране нейтрофилов, константы прямой и обратной реакций взаимодействия лиганд-рецептор для популяции нейтрофилов.

Выводы номер 1, 2 и 3 раздела “Выводы” сделаны по результатам данной главы.

Основные результаты данной главы представлены в следующих работах:

1 Д.Ю. Орлова, М.А. Юркин, К.А.Семьянов, В.П.Мальцев, Оптические свойства гранулярных клеток крови: нейтрофилы. Вестник НГУ, Серия: Физика. Том 2 (4), с.

83-87, 2007.

2 D.Yu. Orlova, M.A. Yurkin, A.G. Hoekstra, and V.P. Maltsev. Light scattering by neutrophils: model, simulation and experiment. Journal of Biomedical Optics. Vol. 13(5), 054057, pp.1-7, 2008.

3 D. Yu. Orlova, V. I. Borisov, V. S. Kozhevnikov,V. P. Maltsev and A. V. Chernyshev, Distribution function approach to study the kinetics of IgM antibodies binding to FcRIIIb (CD16b) receptors on neutrophils by Flow Cytometry. Journal of Theoretical Biology.

Accepted. DOI: 10.1016/j.jtbi.2011.08.026.

Глава 4 Исследование внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий В данной главе представлены результаты разработки метода лазерной сканирующей микроскопии для исследования кинетики обратимого лигандрецепторного взаимодействия в среде с неоднородным распределением сайтов связывания. Также приведена проверка разработанного метода на простых (без сайтов связывания) и сложных (неоднородных по распределению сайтов связывания) средах.

Такой метод является особенно полезным инструментом при исследовании высоко неоднородных сред, например, ядро живой клетки, для которых невозможно получить аналитическое решение реакционно-диффузионных дифференциальных уравнений в силу неизвестности математической функции пространственного распределения неоднородностей.

4.1. Метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания 4.1.1. Общая формулировка Метод FRAP (восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания) был разработан в 1970-х годах для изучения диффузии белков и липидов в мембранах.

Типичный FRAP эксперимент – это обесцвечивание флуоресцирующих молекул в небольшой области исследуемого образца при кратковременном облучении интенсивным лазерным излучением (т.е. необратимое фотообесцвечивание) и наблюдение процесса восстановления флуоресценции данной области за счёт диффузии необесцвеченных молекул.

4.1.2. Кинетическая схема процесса FRAP эксперименты содержат информацию о диффузионных свойствах молекул и о свойствах лиганд – рецепторного взаимодействия (константа эффективной диффузии, константы скорости ассоциации и диссоциации) этих молекул со специфическими сайтами связывания.

Полагают, что диффузия сайтов связывания (и связанных комплексов) пренебрежимо мала во временном и пространственном масштабе FRAP измерений.

Такое приближение широко используется, например, для FRAP исследований цитоскелета и ДНК - связанных белков, где сайты связывания являются частью большого, относительно неподвижного комплекса [196, 197]. Кроме того, используют предположение, что собственный коэффициент диффузии D свободного (несвязанного) белка является постоянным (т.е. не зависит от пространственных переменных и времени). Тогда дифференциальные уравнения двумерной диффузии для лигандрецепторного типа связывания в общепринятом виде выглядят следующим образом [198]:

где х и у пространственные переменные; t время, F концентрация свободного (несвязанного) белка; A концентрация свободных сайтов связывания (рецепторы); B концентрация связанного белка (комплексов лиганд - рецептор); k+ константа скорости ассоциации, k- константа скорости диссоциации.

4.2. Результаты 4.2.1. Разработка нового FRAP метода для неоднородных сред Для разработки FRAP метода для неоднородных сред мы использовали общепринятый вид дифференциальных уравнений двумерной диффузии для лигандрецепторного типа связывания (50). Однако, подчеркнем, что, в отличие от общепринятых моделей FRAP, пространственное распределение мест связывания в нашей модели считается неоднородным, то есть концентрация A является функцией пространственных переменных, как и все другие концентрации в уравнении (50).

Наблюдаемая интенсивность флуоресценции в определенной точке пространства (х,у) пропорциональна сумме свободного и связанного флуоресцентного белка: I(x,y,t) = F(x,y,t) + B(x,y,t). Таким образом, из системы уравнений (50) видно, что:

Как правило, система уравнений (50), значительно упрощается благодаря предположению, что система достигла равновесия до момента фотообесцечивания (отмечено нижним индексом “b”- от англ. before), и, что концентрация мест связывания и общее количество белка, меченного GFP, остается постоянной в течение FRAP эксперимента. Это разумное и широко используемое приближение, так как типичная продолжительность FRAP экспериментов составляет от нескольких секунд до нескольких минут, тогда как синтез белков в клетке происходит в течении нескольких часов [198]. Обозначая локальную константу равновесия K(x,y) как:

получаем из системы уравнений (52) следующее выражение для интенсивности флуоресценции, наблюдаемой до фотообесцвечивания:

Следует отметить, что концентрация несвязанного белка до обесцвечивания, Fb, не зависит от (х,у), так как нет никаких изменений локальной концентрации в стационарных условиях ( I b ( x, y, t ) / t = 0 ).

флуоресцентные молекулы белка в нефлуоресцентные, но при этом общая концентрация белка (обесцвеченного плюс необесцвеченного) в каждой точке (х,у) остаётся неизменной. Поэтому и локальная концентрация свободных мест связывания A(x,y) остается неизменной на временном масштабе FRAP эксперимента. Но в распределение отдельно для обесцвеченных и для необесцвеченных молекул белка, и фотообесцвечивания возникают нестационарные условия, которые мы рассматриваем в контексте диффузионно-доминирующей модели [198]. Диффузионно-доминирующая модель применяется при условии, что время ассоциации GFP-меченного белка гораздо меньше времени необходимого для диффузии белка в обесцвеченную область. При увеличении размера обесцвечиваемой области (что приводит к увеличению времени, необходимого для диффузии белка в обесцвеченную область), область применимости диффузионной модели может быть расширена за счет исследования объектов с более медленными скоростями ассоциации. В соответствии с диффузионно-доминирующей моделью, реакция лиганд-рецепторного связывания остается в равновесии, и после обесцвечивания:

где F ( x, y, t ) - концентрация свободного (несвязанного) необесцвеченного белка.

Принимая во внимание уравнение (54) и уравнение (56), уравнение (51) может быть модифицировано следующим образом:

преобразование «синус-окно») к уравнению (57) по пространственным переменным (x,y) в области прямоугольного видеокадра FRAP (0 x a; 0 y b) дает:

Можно сказать, что пространственная частота, использованная в интегральном преобразовании уравнения (59) ниже (в 2-раза), чем самая низкая пространственная частота метода Фурье, что должно еще больше снижать уровень экспериментального шума. Применение правил интегрирования по частям для левой части уравнения (59) даёт:



Pages:     | 1 |   ...   | 9 | 10 || 12 | 13 |   ...   | 17 |
 


Похожие материалы:

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.