WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 10 | 11 || 13 | 14 |   ...   | 17 |

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

-- [ Страница 12 ] --

где “^” означает синус-взвешенное интегрирование функции по видеокадру, а функция J(t) определяется по значениям функции I ( x, y, t ) на границе видеокадра:

Из уравнения (60), усредненный коэффициент эффективной диффузии может быть получен следующим образом. Учитываем отношение между средними Ib и средним K по всему видеокадру, что следует из уравнения (54):

Принимая во внимание уравнение (62), уравнение (61) может быть переписано в виде:

Экспериментальные функции S(t) и G(t) можно вычислить непосредственно из экспериментальных видео-FRAP данных. Но невозможно получить эти функции теоретически, если пространственное распределение сайтов связывания неизвестно.

Таким образом, стандартная схема обработки экспериментальных данных методом нелинейной регрессии с использование аналогичной теоретической зависимости с целью получения искомого коэффициента эффективной диффузии в данном случае неприменима. Однако, при произвольном пространственном распределении мест связывания, можно получить коэффициент эффективной диффузии Deff путём сравнительного анализа экспериментальных функций S(t) и G(t) учитывая теоретическое соотношение между ними (уравнение (63)). Основная трудность состоит в наличии шума в экспериментальных данных, так как это снижает точность расчёта производной экспериментальной функции G(t) по времени. Вместо того, чтобы вычислять производную, мы предлагаем провести интегрирование (что является более стабильным по отношению к шуму) уравнения (63) по времени (с переменным верхним пределом, p), что приводит к следующему уравнению для Deff:

сканирующего конфокального микроскопа. Количество кадров, p, в обработке данных варьировалось для оценки погрешности Deff (как стандартная ошибка среднего).

4.2.2. Апробация метода на простых системах 4.2.2.1. Проверка метода на примере ядер живых клеток Был проведён тест для проверки общей применимости нового метода FRAP для исследования процессов внутри ядер живых клеток. Как пример, была измерена фибробласта. Следует отметить, что динамические свойства HP1, HP1 и HP1 очень похожи, поэтому проверка метода была сделана только для случая HP1 (Рис. 29 - Рис.

31). Чтобы увеличить отношение сигнал/шум, выбирали довольно большую (примерно половина ядра) область фотообесцвечивания (ROB)- Рис. 29А.

Учитывая известные из литературы [199] значения для таких систем (HP1 в ядрах мышиных эмбриональных фибробластов (MEF)) D ~24 мкм2/с, k+A ~1.7 с-1, и k-~0.6 с-1 – можно теоретически доказать (с помощью выражения (k- + k+A)-1 (Dw2)-1) что диффузионно-контролируемый сценарий применим в данном случае, если исследуемая область объекта (ROI) больше 3 мкм. Применимость 2D диффузионной модели (вместо полной 3D) была экспериментально проверена исследованием изменения полной интенсивности фрейма во времени (Рис. 29). Из Рис. 29Б видно, что полное значение флуоресценции от исследуемого образца не изменяется во времени после фотовыжигания (в пределах шума). Рис. 29 иллюстрирует случай, когда прямоугольное ROI совпадает с целым видео-фреймом. Зависимость коэффициента эффективной диффузии Deff от числа фреймов, необходимая для оценки соответствующего параметра, представлена на Рис. 29Г. Соответствующие экспериментальные зависимости функций G (T) и S (T) приведены на вставках Г1 и Г2 в Рис. 29Г.

Изменение коэффициента эффективной диффузии Deff в зависимости от числа фреймов позволяет оценивать стандартную ошибку этого параметра.

Рис. 29. (А) FRAP эксперименты по анализу мобильности хроматин-ассоциированных белков; изображения GFP-меченных белков HP1b в MEF клетках были получены до и после фотообесцвечивания примерно половины ядра клетки; фреймы были сняты через указанные промежутки времени (t) после окончания обесцвечивания лазерным пучком большой бощности. (Б) Типичная зависимость изменения флуоресценции во времени до и после фотообесцвечивания (t=0 c), где полная интенсивность флуоресценции представляет собой суммарное значение по всему фрейму (данные, полученные во время фотообесцвечивания, опущены). (В) Типичная зависимость изменения флуоресценции во времени до и после фотообесцвечивания (t=0 c), где полная интенсивность флуоресценции представляет собой суммарное значение по фотообесцвеченной области фрейма (данные, полученные во время фотообесцвечивания, опущены). (Г) Вычисление Deff как функции от числа фреймов, полученных после фотообесцвечивания, в случае, когда прямоугольный ROI совпадает с целым видео-фреймом. (Вставка Г1) Экспериментально полученная функция G(t). (Вставка Г2) Экспериментально полученная функция S(t).

Рис. 30. Вычисление Deff как функции от числа фреймов, полученных после фотообесцвечивания, в случае, когда размер ROI (белый прямоугольный контур) меньше, чем целый видео-фрейм. (A) Случай, когда ROI частично внутри ядра клетки.

(Б) Случай, когда ROI полностью внутри ядра клетки. (A1, Б1) Соответствующие экспериментально полученные функции G(t). (A2, Б2) Соответствующие экспериментально полученные функции S(t). (A3, Б3) Соответствующие вычисления Deff как функции от числа фреймов, полученных после фотообесцвечивания.

Два случая обработки одних и тех же экспериментальных данных с помощью двух разных прямоугольных ROI (меньших по размеру, чем весь видео-фрейм) представлены на Рис. 30. Проверка метода была успешна, так как полученные результаты находятся в хорошем согласии с данными, известными из литературы для таких же систем (HP1 в ядрах мышиных эмбриональных фибробластов) [199].

4.2.2.2. Проверка метода на FITC-HSА в растворе глицерин/вода Мы протестировали метод на простейшей системе – однородная среда без связывающих центров (K(x,y)=0) -для того, чтобы сравнить наши результаты с известными из литературы. Эксперименты проводили при температуре 30 С. Три различные формы области выжигания (ROB) были использованы при проведении экспериментов по исследованию мобильности молекул FITC-HSA в растворе глицерин/вода в случае, когда прямоугольный ROI полностью совпадает с видеофреймом, как это показано на Рис. 31 A-В. В результате мы наблюдали хорошее согласие (Таблица 6) между полученными нами и известными из литературы [200] коэффициентами эффективной диффузии, пересчитанными для значения температуры 30 C, принимая во внимание температурные зависимости коэффициента диффузии [201].

Рис. 31. (A-В) FRAP тест по измерению диффузии молекул FITC-HSА в растворе глицерин/вода без связывающих центров для различных областей фотовыжигания (ROB) в случае, когда прямоугольный ROI полностью совпадает с видео-фреймом. (Г и Д) FRAP тест по измерению коэффициента эффективной диффузии Deff GFP-меченных белковых молекул в ядрах живых клеток при различных позициях области фотовыжигания. (Е-З) FRAP тест по измерению коэффициента эффективной диффузии Deff GFP-меченных белковых молекул в ядрах живых клеток при различных размерах области фотовыжигания.

Таблица 6. Коэффициент диффузии молекул FITC-HSА в смеси глицерин/вода (80% по весу, фосфатно-солевой буфер 0,05 М, рН 8), полученный в наших FRAP экспериментах при различных областях фотовыжигания (ROB), в случае, когда прямоугольный ROI полностью совпадает с видео-фреймом.

FITC-HSА в р-ре D, мкм2/c 4.2.2.3. Проверка метода на GFP-HP1 в ядрах живых клеток, используя различные позиции области фотовыжигания Экспериментальная верификация независимости (в пределах шума) получаемого коэффициента эффективной диффузии Deff от позиции области фотовыжигания (ROB) для сильно неоднородных сред (ядро живой клетки) в случае, когда прямоугольный ROI полностью совпадает с видео-фреймом, проиллюстрирована на Рис. 31 Г и Д.

Эксперименты были выполнены последовательно на ядре одной и той же клетки.

Полученные коэффициенты эффективной диффузии представлены в Таблице 7.

Таблица 7. Коэффициент эффективной диффузии GFP-меченых белковых молекул в ядре живой клетки, полученный при различных позициях и размерах ROB в случае, когда прямоугольный ROI полностью совпадает с видео-фреймом. Г,Д и Е,Ж,З – тесты, проведённые на двух разных клетках.

MEF-wt Deff, мкм2/c Как можно видеть, флуктуации значений Deff при изменении позиции ROB находятся в пределах ошибки вычислений. Значения Deff хорошо согласуются со значениями известными из литературы для таких же систем [199].

4.2.2.4. Проверка метода на GFP-HP1 в ядрах живых клеток, используя различные размеры области фотовыжигания Экспериментальная верификация независимости (в пределах шума) получаемого коэффициента эффективной диффузии Deff от размера области фотовыжигания (ROB) для сильно неоднородных сред (ядро живой клетки) в случае, когда прямоугольный ROI полностью совпадает с видео-фреймом, проиллюстрирована на Рис. 31 Е - З.

Эксперименты были выполнены последовательно на ядре одной и той же клетки.

Полученные коэффициенты эффективной диффузии представлены в Таблице 7. Как можно видеть, флуктуации значений Deff при изменении размера ROB находятся в пределах ошибки вычислений. Значения Deff хорошо согласуются со значениями известными из литературы для таких же систем [199].

4.2.3. Исследование мобильности гетерохроматиновых белков Разработанный нами FRAP метод был применён (по описанному выше FRAP протоколу) для исследования динамики белков HP1 (,,) в ядрах живых клеток (Рис.

32, А и Б) в случае, когда прямоугольная область наблюдения (ROI) полностью совпадает с видео-фреймом. Была проведена трансфекция белками HP1-GFP (HP1, HP1, и HP1) эмбриональных мышиных фибробластов (MEFs) от нокаутных мышей типа Suv39h1/2-/- и Lmna-/- и соответствующих мышей дикого типа (wt).

Рис. 32. Результаты применения FRAP метода для исследования динамики белков HP (,,) в ядрах живых клеток в случае, когда прямоугольная область наблюдения (ROI) полностью совпадает с видео-фреймом. Средние значения (точки) и стандартные ошибки среднего (“усы”) коэффициента эффективной диффузии, измеренного для различных изоформ белка HP1 в клетках типа Suv39h (A) и Lmna (Б). Где ++ дикий тип клеток; – нокаутные клетки по Suv39h1/2 (A) или по Lmna (Б). Числа под средними значениями означают количество обработанных клеток. +TSA – клетки, измеренные через 2 часа после добавления трихостатина А.

Для измерения динамики HP1 в ядрах живых клеток мы провели скрининг различных линий MEF клеток, экзогенно экспрессирующих GFP-HP1 различных изоформ. Большая стандартная ошибка в определении коэффициента эффективной диффузии для различных клеточных популяций, представленная на Рис. 32 A и Б, возникает из за биологической вариабельности и относительно малого числа измеренных клеток. Анализ полученных коэффициентов эффективной диффузии выявил различия для подтипов белка HP1, основанные на наличии или отсутствии гистоновых метилтрансфераз.

В клетках типа Suv39h1/2-/- MEFs мобильность белка HP1 была медленнее относительно белков HP1 и HP1, свидетельствуя тем самым об отсутствии гистоновых метилтрансфераз Suv39h1 и Suv39h2.



Pages:     | 1 |   ...   | 10 | 11 || 13 | 14 |   ...   | 17 |
 


Похожие материалы:

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.