WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 11 | 12 || 14 | 15 |   ...   | 17 |

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

-- [ Страница 13 ] --

4.3. Обсуждение результатов Основное преимущество предложенного FRAP метода заключается в том, что он позволяет количественно описывать одновременно и диффузию и лиганд рецепторное взаимодействие молекул (определять коэффициент эффективной диффузии) в среде с неоднородным распределением сайтов связывания, не требуя при этом аналитического решения реакционно-диффузионных дифференциальных уравнений. Использование относительно большой области фотообесцвечивания позволяет расширить границы применения эффективно-диффузионного подхода на исследование медленных лиганд – рецепторных взаимодействий, которые не могут быть количественно описаны в диффузионном пределе с помощью обычных FRAP методов (фотообесцвечивание малой области исследуемого объекта). Такой метод является особенно полезным инструментом при исследовании высоко неоднородных сред, например, ядро живой клетки, для которых невозможно получить аналитическое решение реакционно-диффузионных дифференциальных уравнений в силу неизвестности математической функции пространственного распределения неоднородностей.

Метод, предложенный в данной работе, не зависит от геометрии области фотообесцвечивания, от профиля луча лазера, от пространственного распределения мест связывания, а также от положения объекта исследования в наблюдаемом фрейме.

Поэтому, такой подход может быть легко адаптирован для исследования, например, около сотни клеток за час при использовании FRAP метода в режиме одна клетка на фрейм. Это позволит набирать надёжную статистическую экспериментальную выборку за относительно небольшой промежуток времени.

У предложенного метода есть несколько ограничений. Наиболее значительным является то, что константы скорости ассоциации и диссоциации не определяются независимо друг от друга в рамках такого подхода. Однако, из константы эффективной диффузии можно вычислить константу равновесия, что представляет собой отношение вышеупомянутых параметров. Ещё одним недостатком предложенного FRAP метода является то, что он может быть применён только в диффузионном пределе (хотя, как говорилось ранее, границы применимости могут быть расширены на исследование медленных реакций за счёт использования большей области фотообесцвечивания).

Также, есть ряд упрощений, присущих и стандартным FRAP методам [163,165]: клетки не движутся во время FRAP экспериментов; коэффициент диффузии D – константа (т.е.

не зависит от пространственных координат и времени); диффузия сайтов связывания считается незначительной и т.д. Для дальнейшего развития метода FRAP следует учесть хотя бы часть из перечисленных допущений.

Выводы номер 4 и 5 раздела “Выводы” сделаны по результатам данной главы.

Основные результаты данной главы представлены в работе:

D. Yu. Orlova, E. Brtov, V. P. Maltsev, S. Kozubek, and A. V. Chernyshev. A nonfitting method using a spatial sine window transform for inhomogeneous effectivediffusion measurements by FRAP. Biophysical Journal. Vol. 100(2), pp. 507 – 516, 2011.

Заключение В первой части данной работы исследовалась кинетика обратимого лиганд рецепторного взаимодействия в гетерогенной системе, а именно на поверхности живых клеток. Для исследования использовался метод проточной цитометрии.

Экспериментально исследована кинетика связывания флюоресцеин-меченых мышиных моноклональных антител с поверхностными рецепторами FcRb нейтрофилов человека.

Теоретический анализ кинетики лиганд - рецепторного взаимодействия был сфокусирован на задаче описания экспериментальных данных, получаемых в проточной цитометрии, то есть на описании временной эволюции распределения по флуоресценции. Применена математическая модель обратимого процесса образования комплекса «лиганд-поверхностный рецептор клетки», использующая понятие функции распределения клеток по количеству рецепторов, то есть учитывающая гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов. Модель использует весь набор экспериментальных данных, получаемых в кинетическом эксперименте на проточном цитометре, и позволяет оценить влияние гетерогенности клеточной популяции на кинетику процесса.

В рамках второй части данной работы был разработан новый метод FRAP для определения эффективной диффузии молекул в неоднородной среде. Этот метод основан на GFP технологии, пространственных измерениях, использующих видеоFRAP метод, лазерно-сканирующую конфокальную микроскопию и анализ результатов с использованием математической модели, которая отражает реальную ситуацию во многих случаях. Такой подход расширяет область применения количественного FRAP анализа для неоднородных сред. Наш метод был успешно применён для исследования внутриядерной диффузии и лиганд – рецепторных взаимодействий в живых клетках, экспрессирующих белок HP1-GFP. Полученные значения коэффициента эффективной диффузии находятся в хорошем согласии с известными литературными данными.

Проведенная работа позволила развить потенциал метода проточной цитометрии для исследования мембранных обратимых лиганд-рецепторных взаимодействий и метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечиванния для сильно неоднородных сред.

Выводы 1 Исследована кинетика связывания растворенных лигандов с низкоаффинными усовершенствованной методики решения обратной задачи биокинетики оценены значения констант скоростей прямой и обратной реакций взаимодействия лиганда с рецептором FcRb, которые для.одиночной лиганд-рецепторной пары «1D3 IgM – FcRIIIb» равны k+=(7.5±1.0)10-16 см3/cек и k-=(2.1±0.8)10- 1/cек, соответственно.

2 Определено абсолютное распределение рецепторов FcRb в клеточной популяции нейтрофилов человека. Показано, что их среднее количество варьирует у пациентов от 0.5105 до 3105 на клетку.

3 Впервые измерена зависимость дифференциального сечения рассеяния от угла рассеяния для нейтрофилов человека. Для объяснения данных экспериментов предложена сферическая оптическая модель нейтрофила, учитывающая влияние на процесс светорассеяния сегментированности ядра и зернистости цитоплазмы.

4 Константа эффективной диффузии молекул лигандов в среде с неоднородным распределением сайтов связывания (рецепторов) может быть определена без реакционно-диффузионных уравнений.

5 Среднее значение константы эффективной диффузии белка HP1 в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов Suv39h1/2+/+ и Suv39h1/2-/- равно (5.7 ± 0.8) 10-8 см2/с и (4.9 ± 0.4) 10-8 см2/с, соответственно. После обработки клеток трихостатином A, вызывающим ацетилирование гистонов на всем протяжении геномной ДНК, среднее значение константы эффективной диффузии белка HP в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов Suv39h1/2+/+ и Suv39h1/2-/- равно (3.9 ± 0.6)·10-8 см2/с и (3.4 ± 0.3)·10-8 см2/с, соответственно.

Основные результаты работы докладывались на:

1. Международной конференции по биологическим и экологическим наукам (Египет, Хургада, 13 – 16 марта 2008 г.);

2. Международной конференции “Использование ГМО в научных исследованиях” (Чехия, Брно, 8 – 9 апреля 2010 г.);

3. XXV конгрессе международного общества развития цитометрии, ISAC (США, Сиэтл, 8-12 мая 2010 г.);

4. Международной конференции“Эпигенетика” (Чехия, Брно, 22 – 25 ноября 2010 г.);

5. Международной конференции “Динамика систем внутриклеточной связи” (Швейцария, Энгельберг, 15 – 19 мая, 2011 г.);

6. Научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Россия, Новосибирск, 2008 - 2011), Институте биофизики Чешской академии наук (Чехия, Брно, 2009 - 2011) и Институте клинической иммунологии СО РАМН (Россия, Новосибирск, 2009).

и опубликованы в следующих работах:

статьи в реферируемых изданиях:

1. Д.Ю. Орлова, М.А. Юркин, К.А.Семьянов, В.П.Мальцев, Оптические свойства гранулярных клеток крови: нейтрофилы. Вестник НГУ, Серия: Физика. Том 2 (4), 2. D.Yu. Orlova, M.A. Yurkin, A.G. Hoekstra, and V.P. Maltsev. Light scattering by neutrophils: model, simulation and experiment. Journal of Biomedical Optics. Vol.

13(5), 054057, pp.1-7, 2008.

3. E. Brtov, A. Harniarov Horkov, R. Uhlov, I. Raka, G. Galiov, D. Orlova, S.

Kozubek. Structure and epigenetics of nucleoli in comparison with non-nucleolar compartments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. Vol. 58(5), pp. 391 – 403, 4. D. Yu. Orlova, E. Brtov, V. P. Maltsev, S. Kozubek, and A. V. Chernyshev. A nonfitting method using a spatial sine window transform for inhomogeneous effectivediffusion measurements by FRAP. Biophysical Journal. Vol. 100(2), pp. 507 – 516, 5. D. Yu. Orlova, V. I. Borisov, V. S. Kozhevnikov,V. P. Maltsev and A. V. Chernyshev, Distribution function approach to study the kinetics of IgM antibodies binding to FcRIIIb (CD16b) receptors on neutrophils by Flow Cytometry. Journal of Theoretical Biology. Accepted. DOI: 10.1016/j.jtbi.2011.08.026.

Избранные тезисы в сборниках конференций:

1. D. Orlova, E. Brtov, A. Harniarov Horkov, Study on chromatin dynamics in living cells by the use of confocal microscopy and FRAP technique. Student scientific conference for students working with genetically modified organisms (GMOs), Brno, Czech Republic, April 8-9th, p. 64, 2010.

2. A.V. Chernyshev, D.Yu. Orlova, V.I. Borisov, V.S. Kozhevnikov, V.P. Maltsev, Time evolution of the cellular fluorescence distribution in dynamic flow cytometry:

theoretical modeling and experimental verification for the kinetics of 1D3 IgM monoclonal antibodies binding to FcyRIb receptors (CD16b) on neutrophils. XXV Congress of the International Society for Advancement of Cytometry, Seattle, Washington, USA, May 8-12, p. 184, 2010.

3. Darya Yu. Orlova, E. Bartova, V.P. Maltsev, S. Kozubek, and A.V. Chernyshev, A nonfitting FRAP method for two-dimensional effective diffusion measurements based on laser-scanning microscope. COST action TD09/05 Epeginetics-Bench to Bedside, Brno, Czech Republic, November 23-24, p. 58, 2010.

4. Darya Yu. Orlova, E. Bartova, V.P. Maltsev, S. Kozubek, and A.V. Chernyshev, Development of nonfitting FRAP method for inhomogeneous media: application for study mobility intranuclear proteins in living cells. EMBO conference series on systems dynamics and intracellular communication SPATIAL 2011, Engelberg, Switzerland, May 14-19, p. 85, 2011.



Pages:     | 1 |   ...   | 11 | 12 || 14 | 15 |   ...   | 17 |
 


Похожие материалы:

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.