WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 17 |

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

-- [ Страница 3 ] --

1.3. Экспериментальные методы исследования взаимодействия лиганд – рецептор на поверхности живых клеток исследования лиганд - рецепторного взаимодействия на молекулярном уровне, которые позволяют изучать структуру и динамику этого взаимодействия. Каждый из этих методов имеет свои достоинства и недостатки [11]. Молекулярные методы исследования биологических объектов являются динамически развивающейся областью науки, что приводит к появлению новой техники и новых методик исследования. Наибольшее распространение для исследования поверхностных лиганд – радиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ, иммуноагглютинация, поверхностный плазмонный резонанс, техника полного внутреннего отражения, проточная цитометрия [12,13].

Одним из самых первых методов исследования взаимодействия лиганд-рецептор in vitro был метод иммуно-агглютинации [14]. При добавлении би- (и более) валентных лигандов связывание лиганда с поверхностным рецептором приводит к «слипанию»

частиц с образованием больших видимых агрегатов, которые выпадают в осадок.

Традиционно, этот метод используется в диагностических целях, в основном для качественного анализа на наличие или отсутствие антител (или антигена) в крови или других жидкостях [14,15,16]. Субъективность определения границы между агглютинацией, вызванной специфическим связыванием лиганда с рецептором, и неспецифической агрегацией частиц является главным недостатком такого похода.. В последнее время предпринимаются попытки создать автоматические анализаторы на основе явления иммуноагглютинации [17,18].

Метод электронной микроскопии позволяет фактически напрямую наблюдать образование комплексов лиганд-рецептор. Электронная микроскопия, по сути, является качественным референс-методом, с которым сравниваются результаты исследования другими методами. Однако, в силу сложности приготовления образцов для микроскопического анализа исследование динамики взаимодействия лиганд-рецептор зачастую просто невозможно. В последнее время развивается техника атомно-силовой микроскопии, которая является многообещающим инструментом изучения динамики взаимодействия лиганд-рецептор, но пока соответствующих работ мало [19].

Радиоиммуноанализ (РИА) является классическим количественным методом исследования лиганд-рецепторных взаимодействий. Идея метода состоит в том, что один из реагентов (чаще всего рецептор) метится радиоактивным изотопом (3H, 35P…).

После проведения реакции каким-либо способом (один из наиболее распространенных – разделение на мембранах) разделяют связанные комплексы лиганд-рецептор от не связавшихся реагентов и измеряют радиоактивность остаточного раствора и фракции комплексов [5].

взаимодействия. Кинетические работы не столь многочисленны, но посвящены как кинетике ассоциации, так и кинетике диссоциации [20,21]. Метод характеризуется очень высокой чувствительностью. Главной методической трудностью является задача разделения фракций, что, собственно, и затрудняет исследование кинетики [20]. В последнее время РИА все больше вытесняется флуоресцентными и сходными методами, в том числе и по соображениям безопасности.

иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA) [22]. Метод принципиально сходен с РИА, но в качестве метки используется молекула фермента, ковалентно связанная с одним из реагентов. После разделения связанных и свободных реагентов проводится ферментативная реакция, дающая в результате окрашенный продукт в условиях избытка субстрата. Реакция останавливается (или замедляется), и количество наработанного продукта измеряется спектрофотометрическим способом. Метод характеризуется высокой чувствительностью, хотя и несколько более сложной методикой проведения. Наибольшее значение ИФА имеет для определения наличия антител или антигенов в крови или других биологических жидкостях в различных тестсистемах [23]. Так же, как и в случае РИА, наиболее распространенными объектами исследования являются белки, их мембранные фракции, вирусные частицы, реже фиксированные клетки. Проведение кинетических исследований затруднено в силу большого количества стадий после процесса непосредственного связывания антигена и антитела, необходимых по протоколу.

радиоиммуноанализом и с иммуноферментным анализом [12]. В качестве метки используется молекула флуоресцирующего красителя, связанная с одним из регентов.

Спектр используемых красителей очень широк (наиболее часто используются флуоресциин, родамин, фикоэритрин), и он непрерывно увеличивается. Выбор красителя определяется объектом исследования и соответствующей задачей, а также методом исследования. Краситель может быть связан с биомолекулой как ковалентно, так и нековалентно. ИФлА позволяет проводить как визуальные наблюдения с Количественные исследования проводятся на флуориметрах или с помощью техники проточной цитометрии, для которой данный метод является одним из перспективных инструментов в исследовании клеточных процессов.

Следует отметить, что чувствительность ИФлА несколько ниже, чем у ИФА, что объясняется наличием неспецифической автофлуоресценции (флуоресценции самих биомолекул) и меньшим усилением исходного сигнала. Влияние неспецифической автофлуоресценции становится особо значимым, когда объектом исследования являются не отдельные биомолекулы, а субклеточные структуры или сами клетки.

иммунофлуоресцентного анализа (Time-Resolved ImmunoFluorescence Analysis, TRIFA), основанного на использовании в качестве флуоресцирующей метки молекулы с большим временем жизни возбужденного состояния (чаще всего комплексы, содержащие атомы переходного металла) [24,25]. Так как время высвечивания неспецифической флуоресценции гораздо меньше, чем специфической, то появляется возможность разделить неспецифическую флуоресценцию и полезный сигнал с помощью разнесенных по времени измерений.

Дальнейшим развитием этой идеи стал метод, основанный на переносе флуоресцентного возбуждения с донора на акцептор (FRET, fluorescence resonanse energy transfer) [26]. FRET является мощным методом исследования структуры поверхностных рецепторов клеток, и, более того, позволяет получать информацию об их латеральной динамике [27]. Использование данного метода для кинетических измерений процесса связывания лиганда с рецептором на поверхности клетки затруднено, так как необходимо использовать два флуоресцентно меченых реагента, хотя в данном случае уменьшается вклад неспецифического сигнала. Главное достоинство метода заключается в отсутствии необходимости разделять связанные комплексы от несвязанных реагентов. FRET нашел наибольшее применение для исследования кинетики гомогенной реакции связывания молекулы антигена с молекулой антитела [28].

Количественные исследования в большинстве своем основаны на использовании светорассеяния [18], хотя существуют работы, в которых использовалась система обработки изображения с ультрамикроскопа. Как правило, исследования проводятся на ансамбле частиц, и большинство результатов было получено, когда количество частиц в конгломерате уже высоко [29,30,31]. Поэтому представляет интерес исследование агрегации частиц на раннем этапе взаимодействия. Агглютинация является одной из разновидностей агрегации. В научных работах исследуются как структура, так и динамика агрегирующих частиц. Так была показана фрактальная структура образующихся агрегатов, и были продемонстрированы различные режимы протекания реакции – кинетический и диффузионный [29,30,32,33]. С другой стороны, интерес к агрегации частиц обусловлен тем, что этот процесс лежит в основе различных биологических явлений – агрегации эритроцитов, тромбоцитов, нейтрофилов, свертывания крови и т.д. [34,35].

Недавно был разработан новый метод, позволяющий проводить кинетические исследования от секундного диапазона – метод поверхностного плазмонного резонанса (Surface Plasmon Resonance, SPR) [36]. Метод основан на существовании резонансного ослабления пучка света при полном внутреннем отражении от поверхности.

Резонансное ослабление зависит от вещества, связанного с поверхностью, и полагается линейно связанным с массой вещества на поверхности (а, значит, и линейно связано с концентрацией связавшихся из раствора антител) в широком диапазоне концентраций.

Этим методом за последнее десятилетие было получено большое количество экспериментальных кинетических данных по взаимодействию различных биологических молекул.

Технология SPR получает все большее распространение в экспериментальной практике в различных методических вариациях [37]. К методическим трудностям метода следует отнести влияние способа нанесения иммобилизованного агента на поверхность, существование неспецифического связывания [36,38]. Также в большинстве работ при анализе данных не учитывается гетерогенность экспериментальной системы, что зачастую приводит к невозможности сравнить полученные результаты с результатами других экспериментов. Последнее замечание важно, если учесть некоторые трудности при моделировании диффузии к поверхности (например, расходимость метода, используемого при расчете диффузионного потока к сфере), хотя эта задача и допускает различные варианты решения [39,40].

Идея метода SPR сходна с методом микроскопии полного внутреннего отражения (TIRM – Total internal reflection microscopy [41]) в сочетании с корреляционной спектроскопией флуоресценции [42,43]. Однако, в отличие от SPR, на сегодняшний день нет доступных коммерческих инструментов, использующих технологию TIRM.

Несмотря на некоторые сложности, в настоящее время из кинетических методов метод SPR развивается наиболее бурно, особенно с целью создания биологических микрочипов для одновременного анализа биологических жидкостей на большое количество биологических маркеров. Главным ограничением в области применения SPR для исследования динамики реальных систем лиганд-рецептор является ограничение на объекты исследования, которыми должны быть молекулы, что пока делает невозможным исследованием взаимодействия лиганд-рецептор на клеточном уровне.

Исследование биологических клеток часто требует проведения статистических исследований ввиду большого разнообразия биологических клеток по параметрам даже в пределах одной популяции. Проводить такие статистические исследования под микроскопом чрезвычайно трудоемко, так как речь идет о статистике сотен и тысяч клеток, которые желательно измерить за короткое время, особенно если речь идет о кинетических исследованиях клеточных процессов. Путь решения данной проблемы лежит в создании и использовании автоматических анализаторов одиночных клеток, наиболее производительные из которых – проточные цитометры [44]. Проточная цитометрия позволяет исследовать физические, биохимические и функциональные свойства индивидуальных клеток (или других микрочастиц) с большой скоростью накопления данных (до десятков тысяч частиц в секунду). Непосредственно измеряемыми параметрами являются обычно светорассеяние и флуоресценция.

Использование флуоресценции позволяет исследовать самые разнообразные свойства клеток: от содержания и упаковки ДНК и РНК [45,46] до динамики концентрации внутриклеточных ионов в различных клеточных процессах [47].



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 17 |
 


Похожие материалы:

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.