WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 17 |

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

-- [ Страница 4 ] --

Широкое применение проточные цитометры нашли в иммунологии для фенотипирования различных подклассов лимфоцитов на основе связывания меченых антител с соответствующими антигенами лимфоцитов [48]. Использование флуоресценции для исследования взаимодействия антиген-антитело основано на методике иммунофлуоресцентного анализа. Традиционное применение цитометрии в этой области основано на измерении равновесных характеристик, и главной целью измерений является количество рецепторов на поверхности клеток или лигандов в крови [49]. Хотя первые работы по кинетике связывания меченых лигандов с поверхностными рецепторами появились практически одновременно с появлением техники проточной цитометрии, долгое время количество таких работ было невелико [50]. Только в последние годы существенно возрос интерес именно к кинетике связывания лиганда с рецептором. Использование проточных цитометров в комбинации с ИФлА позволяет измерять динамику взаимодействия лиганд-рецептор на поверхности клеток уже с временного диапазона в несколько десятков секунд после начала реакции [51]. Недавно появились устройства для быстрого смешивания проб, что позволяет уменьшить это время до долей секунд [19,52].

Объектами исследования на проточном цитометре могут быть самые различные микрочастицы (полимерные латексные шарики, клетки, бактерии и т.д.) размером от 0.3 до 100 мкм. Наиболее распространенной практикой является использование фиксированных клеток при исследовании кинетики взаимодействия антиген-антитело [47]. В последнее время проточные цитометры все шире используются для измерения живых (нефиксированных) клеток [19] в связи с интересом к изучению динамики клеточных процессов, агрегации поверхностных рецепторов, клеточного ответа. При этом исследователи сталкиваются с трудностями дискриминации сигналов светорассеяния и флуоресценции живых клеток от «паразитных» сигналов, соответствующих мертвым, разрушенным клеткам, субклеточным компонентам, агрегатам белков и др.

Взаимодействие лиганд – рецептор является ключевым во многих явлениях, протекающих в живом организме. В последние годы наблюдается рост кинетических исследований в данной области. В случае клеточного ответа реакция связывания протекает на поверхности клеток и является гетерогенной, что необходимо учитывать как в теоретических моделях, так и при интерпретации экспериментальных данных.

Проточный цитометр позволяет измерить распределение клеточной популяции по количеству связавшихся антител. Большинство существующих теоретических моделей, описывающих процесс обратимого связывания лиганд - рецептор, используют средние величины. То есть неявно предполагается, что все клетки имеют одинаковое количество рецепторов. Тем самым учитывается не вся информация, получаемая в эксперименте.

Следует отметить, что в начале 21 века была опубликована работа [53] по исследованию образования поверхностных комплексов лиганд – рецептор с помощью сканирующей проточной цитометрии. Однако, предложенная математическая модель не была доведена для практического применения в случае обратимого лиганд – рецепторного взаимодействия.

1.4. Ядро – динамичная среда Ядерные рецепторы представляют собой ДНК-связывающие транскрипционные факторы (белки, контролирующие перенос информации с молекулы ДНК в структуру мРНК, путём связывания со специфичными участками ДНК) с консервативной доменной организацией, активность которых контролируется липофильными лигандами, фосфорилированием и взаимодействиями с другими белками.

Литература о том, как работают ядерные рецепторы, громадна и поток открытий все новых и новых аспектов взаимодействий рецепторов с лигандами с разными факторами транскрипции не ослабевает. Мутации в ядерных рецепторах приводят к сбоям в гормональной регуляции и ассоциируются с развитием опухолей [54].

Представление об истории развития и современном состоянии исследований в области ядерных рецепторов можно получить из ряда монографий и сборников [55,56,57].

Понимание строения ядра и его функций в живых клетках резко изменилось в последние годы. В настоящее время клетка и её ядро считаются динамичной средой, а не статической, как считалось ранее. Большинство ядерных белков лишь временно привязаны к конкретным ядерным структурам. Высокая мобильность позволяет ядерным белкам выполнять их основную функцию в процессе регулирования жизни клетки, обеспечивая тем самым высокую степень адаптивности клетки к изменяющимся условиями [58,59,60].

Такое понимание ядерной динамики возникло в результате развития новых in vivo микроскопических методов с использованием неинвазивного мечения белков флуоресцентными маркерами, такими как зеленый флуоресцентный белок (GFP) [61,62]. Эти методы открыли совершенно новые способы исследования локализации белков в ядре. Кроме того, использование GFP позволило исследовать динамические процессы, включая лиганд-рецепторные взаимодействия внутри клеток. Наиболее широко используемым методом, в настоящее время, является FRAP (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания) [63].

FRAP исследования нескольких типов ядерных белков показали, что, в отличие от прежних убеждений, многие из этих белков очень мобильны в ядре [58,59]. Такая мобильность чаще всего основывается на диффузии и, следовательно, не требует дополнительных затрат энергии [58]. Это позволяет молекулам белков быстро передвигаться по всему ядру энергетически экономичным способом [60,62].

Эти исследования также показали, что скорость восстановления флуоресценции для большинства белков значительно медленнее, чем можно было бы ожидать для восстановления на основе диффузии [58,64,65]. Последующие исследования позволили получить убедительные доказательства, что восстановление происходит медленнее изза взаимодействия молекул белков с ядерными компонентами, такими как ДНК и гистоновые белки [66,67,68,69,70], по принципу лиганд-рецепторного связывания.

Такие взаимодействия с хроматином позволяют молекулам белков “тестировать” различные последовательности ДНК. Этот процесс имеет большое значение для выполнения основных функций белков. Было высказано предположение, что для многих белков, таких как сайт-специфичные факторы транскрипции, такое выборочное взаимодействие с ДНК является эффективным механизмом поиска специфичных сайтов связывания [71,58,72]. Однако, даже после нахождения сайта связывания, многие белки проявляют динамический характер взаимодействия, указывая, тем самым, на наличие обратной реакции на местах специфического связывания [73,74,75].

Результаты экспериментов по взаимодействию белков с сайтами связывания на ДНК in vivo значительно отличаются от экспериментов, проведённых in vitro, где наблюдается гораздо менее динамичный характер поведения белков. Например, in vitro эксперимент по взаимодействию фактора транскрипции GR (глюкокортикоидных рецепторов) с «чистой» ДНК, показал, что GR находится в области промотора около одного часа [76]. Напротив, последние in vivo исследования показали, что нахождение GR в области промотора длится около одной минуты [74,75].

Вероятным объяснением такого отличия в результатах экспериментов является то, что искусственный in vitro анализ не может учесть всей сложности процессов, происходящих внутри живой клетки, наличия различных факторов, влияющих на взаимодействие белков с сайтами связывания. Во-первых, ДНК не всегда легко доступна в естественных условиях, поскольку она упакована в хроматин более высокого порядка [77].

Также, есть другие ядерные белки, которые могут взаимодействовать с исследуемым белком и модулировать процесс связывания [78]. Кроме того, ядро – плотная среда, в которой неспецифические “фоновые” взаимодействия могут изменять мобильность исследуемых белков [79,80,81,82]. Для более точного описания мобильных свойств белков, in vivo эксперименты являются обязательными.

Для исследования кинетики лиганд – рецепторного взаимодействия в ядре клетки, нужно учитывать неоднородность данной среды по распределению связывающих центров.

1.5. Структура хроматина. Краткое описание Хроматин находится внутри ядра клеток эукариот и входит в состав нуклеоида у прокариот. Именно в составе хроматина происходит начальный этап реализации генетической информации, а также репликация и репарация ДНК.

Хроматин можно определить как комплекс ДНК и связанных с ней белков. У всех эукариот структурной единицей хроматина является нуклеосома – образование из молекул гистонов, формирующих ядро, вокруг которого обвит участок ДНК длиной примерно 145 п.н. ДНК делает около 1,7 оборота вокруг ядра. Соседние нуклеосомы могут находиться на разных расстояниях друг от друга, а плотность и регулярность укладки зависит от функционального состояния участка хроматина. В транскрипционно-активных районах плотность укладки низка – хроматин декомпактизован. Напротив, в гетерохроматинизированных районах (о них будет рассказано ниже) нуклеосомы разделены участками ДНК более-менее постоянной длины (около 40 п.н.) и расположены регулярно. Регуляторные области генов обычно либо свободны от нуклеосом, либо содержат так называемые «позиционированные»

нуклеосомы – то есть нуклеосомы с фиксированным положением относительно последовательности гена [83]. Это необходимо для обеспечения доступа транскрипционных факторов и компонентов транскрипционного комплекса к регуляторным участкам и промотору.

Ядро нуклеосомы состоит из гистонов четырех типов (по два каждого) H2A, H2B, H3 и H4. Гистон H1 участвует во взаимодействии нуклеосом между собой и нужен для их укладки в компактную структуру более высокого порядка – так называемую 30-нм консервативные у всех эукариот. Молекула гистона содержит глобулярную Сконцевую часть и аморфный (не имеющий четко выраженной вторичной структуры) Nконец. N-концы гистонов выступают за пределы ядра и могут взаимодействовать с другими белками хроматина.

Помимо гистонов основных типов, в геноме могут присутствовать минорные варианты, выполняющие специфические функции. В состав хроматина входят также негистоновые структурные белки – HMG, компоненты кинетохора, белки ядерной оболочки, топоизомераза II, и многие другие.

Гистоны не только обеспечивают укладку нити ДНК в ядре, но и активно участвуют в регуляции транскрипции. Это свойство связано с упомянутыми выше Nконцами, основания в которых подвергаются ковалентным модификациям. Гистоны фосфорилированы, АДФ-рибозилированы и убиквитинилированы. Разнообразие вариантов ковалентных модификаций позволяет предполагать наличие уникального гистонового кода, определяющего возможность и уровень экспрессии генов [84,85,86].

На Рис. 4 представлена структура нуклеосомы и варианты ковалентных модификаций гистонов. Число возможных сочетаний разных модификаций очень велико – достаточно, чтобы все нуклеосомы в геноме оказались уникальными.

Рассмотрение всех модификаций гистонов и их сочетаний выходит за рамки данной работы, однако на некоторых вариантах следует остановиться – из-за высокой консервативности и универсальной роли таких модификаций.

Ацетилирование. Наиболее исследовано ацетилирование остатков лизина Nконцов гистонов H3 и H4. Осуществляется ферментами ацетилтрансферазами гистонов Рис. 4 (взято из [88]) Структура нуклеосомы и варианты ковалентных модификаций гистонов.

А. Модель нуклеосомы по данным рентгеноструктурного анализа в двух проекциях.

Гистоны H2A, H2B, H3 и H4 в составе ядра нуклеосомы обозначены разными цветами.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 17 |
 


Похожие материалы:

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.