Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

Б. Варианты ковалентных модификаций гистонов. Подвергающиеся модификациям аминокислоты в концевых районах гистонов обозначены однобуквенным кодом и номером, соответствующим положению начиная с N-конца молекулы. Ac – ацетилирование, Met – метилирование, P – фосфорилирование, Ub – убиквитинилирование, АДФ – АДФ-рибозилирование. Метилированы могут быть лизин и аргинин, ацетилируется лизин, фосфорилируется серин, АДФ-рибозилируется глутаминовая кислота. Синим цветом обозначены модификации, характерные для репрессированного хроматина, красным – для активного. Серым цветом отмечены модификации, связанные с конденсацией хромосом при митозе либо гаметогенезе.

(HAT - histone acetyltransferases). Ацетилирование ассоциируется с активацией транскрипции, хотя, возможно, не для всех вариантов модификаций [87].

Деацетилирование гистонов осуществляется ферментами деацетилазами (HDAC histone deacetylases) и связано с транскрипционной репрессией.

Метилирование. Метилируются остатки лизина, причем каждый остаток может быть моно-, ди- и триметилирован. Метилирование лизина в 9 и 27 положениях гистона H3 связано с транскрипционной репрессией, а метилирование лизина в положении 4 – с активацией транскрипции. Метилирование осуществляют метилтрансферазы гистонов (HMT - histone methyltransferases), деметилирование исследовано слабо [89]. Гистон H3, метилированный по лизину в положении 9 у всех эукариот является маркером гетерохроматина.

Гетерохроматин определялся изначально как часть хроматина, остающаяся конденсированной на протяжении всего клеточного цикла (в противоположность эухроматину). В основном это прицентромерные и теломерные области хромосом.

Структурно гетерохроматин состоит в основном из повторов различных типов и имеет характерный набор белков и модифицированных гистонов, из которых типичен упомянутый выше гистон H3, метилированный по лизину-9. Обычные эухроматиновые гены при переносе в гетерохроматиновое окружение репрессируются на уровне транскрипции. Процесс приобретения участком эухроматина в силу тех или иных причин свойств гетерохроматина называется гетерохроматинизация.

С гетерохроматином ассоциирован ряд белков, взаимодействующих между собой и обеспечивающих поддержание характерного компактного состояния. Наиболее подробно структурные компоненты гетерохроматина исследованы у дрозофилы [90,91,92], однако и у других эукариот имеются сходные компоненты.

Характерными белками гетерохроматина являются:

HDAC1 – деацетилаза гистонов. Деацетилазы имеются у всех эукариот (например, у дрожжей CLR3, у растений HDA6)[93].

SUV39 – метилтрансфераза гистонов, специфично метилирующая лизин- гистона H3. Ортологи имеются у дрожжей (CLR4), растений (KYP), млекопитающих – и, видимо, у всех эукариот [94].

HP1 – гетерохроматиновый белок 1. У дрожжей функциональный эквивалент SWI6, имеются ортологи у растений и млекопитающих.

Характерной особенностью HP1 является наличие хромодомена. Хромодомен – белковый домен, характерный для многих белков хроматина. Хромодомены различаются по структуре, способны связываться с метилированными гистонами и, возможно, с РНК [95,96,97,98]. Хромодомен HP1 и аналогов специфически узнает гистон H3, метилированный по лизину-9 [99].

В формировании гетерохроматина участвует большое количество других белков – компоненты аппарата репликации ДНК [100], ДНКсвязывающие белки (SUVAR 3–7, метилтрансфераз гистонов. Помимо гетерохроматиновых белков, у дрозофилы найдена еще одна система репрессии генов – группа Polycomb (PcG). Группа названа по одному из членов – содержащему хромодомен белку POLYCOMB (PC) и включает более участников [102,103]. В отличие от гетерохроматиновых белков, покрывающих районы генома размером в миллионы п.н., белки Polycomb осуществляют «точечную»

репрессию эухроматиновых генов. Мишени группы – ряд генов, отвечающих за развитие мухи, к примеру гены из кластеров Bithorax и Antennapedia [104,105], общее число мишеней несколько сотен [106,107]. Аналогичные системы обнаружены у растений, млекопитающих, нематоды и, видимо, имеются у всех высших эукариот [108,109,110,111]. Хромодомен PC и родственных белков отличается по специфичности от HP1 и узнает гистон H3, метилированный по лизину в 27-м положении.

Возможны ковалентные модификации не только гистонов, но и ДНК. Это метилирование остатков цитозина с образованием метилцитозина. Подобная модификация ДНК обнаружена и играет большую роль в регуляции транскрипции у млекопитающих, растений, тогда как у дрожжей, нематоды Caenorabditis elegans не обнаружена. У дрозофилы метилирование ДНК незначительно и функции его не вполне ясны [112]. Метилируются обычно основания цитозина в последовательностях вида метилирование, H – A, T или С). В регуляторных областях генов имеются участки, Метилирование осуществляют ферменты ДНК-метилтрансферазы (DMT - dimethyl transferase), представленные у растений и млекопитающих в большом разнообразии [113,114]. Обычно метилирование последовательности гена ассоциировано с транскрипционной репрессией, а сама метилированная ДНК узнается белками, содержащими метилцитозин-связывающий домен (MBD - methyl binding domain) и входящими в состав репрессирующих комплексов [115,116,117].

Структура генома и экспрессия генов зависят от функциональной активности множества белков, ассоциированных с хроматином. Механизмы взаимодействия этих белков с хроматином в интактных клетках до сих пор остаются не раскрытыми.

восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания и кинетического моделирования, позволяет количественно определять основные биофизические параметры (коэффициент диффузии, константу скорости) динамики хроматинсвязанных белков в живых клетках. Это в свою очередь поможет проанализировать механизмы взаимодействия таких белков с хроматином в естественных условиях более детально.

1.6. Белок гетерохроматина HP Проблема регуляции активности генов – одна из важнейших в современной биологии. В настоящее время в центре исследований этого направления стоит феномен Рис. 5. Изоформы гетерохроматинового белка HP1. В диких линиях он локализован в хромоцентрах.

глубокой инактивации генов (silencing, сайленсинг - молчание). Это состояние устанавливается в раннем онтогенезе и затем наследуется в многочисленных циклах деления клетки. Эпигенетическая репрессия генной активности осуществляется мультимерными белковыми комплексами. ДНК-специфичное связывание репрессоров транскрипции с промоторными областями генов инициирует сборку комплексов, модифицирующих гистоны. Определенные комбинации модификаций гистонов, в свою очередь, обеспечивают установление и поддержание репрессированного состояния [118,119,120].

Общими свойствами молчащих районов являются репрессия транскрипции, плотная упаковка и поздняя репликация ДНК в S-фазе клеточного цикла [121,122].

У Drosophila на данный момент хорошо описаны два белковых комплекса, обеспечивающих репрессию. Один из них включает в себя белок HP1 (Heterochromatin protein 1) и гистон-метилтрансферазу SU(VAR)3-9. Этот комплекс собирается в прицентромерном гетерохроматине, репрессированное состояние которого может распространяться на перемещённые к нему эухроматиновые гены при эффекте положения мозаичного типа (ЭПМ). Другой белковый комплекс, в сборке которого основная роль принадлежит белкам группы PC-G (Polycomb Group), осуществляет репрессию эухроматиновых генов. Несмотря на значительные различия этих комплексов, механизмы их действия объединяет ряд общих черт, главной из которых является метилирование гистонов. Состав и функции отдельных компонентов репрессирующих комплексов служат предметом интенсивного изучения.

Heterochromatin protein 1 (HP1) является “держателем” гетерохроматина — транкрипционно молчащей, конденсированной ДНК, которая обычно ассоциирует с центромерными областями. Считается, что HP1 поперечно связывает хроматин, создавая тем самым уплотненный хроматин, который непроницаем для транскрипционных активаторов. Различают три изоформы HP1:,, (Рис. 5).

Члены семейства HP1 характеризуются наличием двух консервативных доменов:

N-концевой хромодомен и С-концевой теневой хромодомен, разделенных линкером переменной длины [123]. Классическая модель функциональной активности HP1 – связывание с модифицированными гистонами посредством хромодомена и взаимодействие с другими белками посредством теневого домена.

Долгое время гетерохроматин рассматривался как инертный, высоко конденсированный и недоступный для транскрипционных факторов домен, в котором белок HP1 играет роль "клея" и является иммобильным. Однако эксперименты, проведённые на живых клетках с помощью метода FRAP показали, что HP1 не стабильно привязан к перицентрическому гетерохроматину, является мобильным и формирует стабильный, активно обновляемый компартмент [124,125]. Таким образом, динамические свойства HP1, возможно, имеют решающее значение в создании постоянно обновляемой, но в целом стабильной, архитектуры хроматина.

1.7. Экспериментальные методы исследования взаимодействия лиганд-рецептор внутри живых клеток Для исследования внутриклеточных процессов более подходящим методом является микроскопия, с помощью которой можно получать информацию об объекте с пространственным разрешением.

С возникновением методов исследования биологических структур с высоким пространственным и временным разрешением задачи структурной клеточной биологии смещаются в сторону изучения динамики клеточных структур и их функциональной активности [126]. Включение измерения времени в структурный анализ позволяет достичь прямой визуализации конформационных изменений, связанных с жизненным циклом биологических объектов. Помимо представления новой информации о функционировании тех или иных биологических структур на молекулярном уровне, такие методы могут стать полезным инструментом для разработки новых подходов в скрининге лекарственных препаратов, например, позволяя идентифицировать препараты, которые стабилизируют определённые каталитические промежуточные продукты.

взаимодействовать с различными клеточными структурами (например, мембраны, хромосомы и т.д.), или участвовать в комплексах, которые диффундируют в цитозоле.

Время взаимодействия макромолекулы с конкретной клеточной структурой – это результат взаимодействия с одним или несколькими рецепторами структуры, который зависит от конформационных изменений макромолекулы. Текущие и будущие задачи структурной клеточной биологии – исследование динамики макромолекул, в частности, лиганд – рецепторных взаимодействий. Динамические измерения – определение кинетических параметров, необходимых для математического моделирования с целью количественного описания поведения клеточных макромолекул.

В настоящее время можно выделить три группы подходов, которые используют для исследования динамики флуоресцентно меченых молекул внутри живых клеток.

Первая группа основана на локальном фотообесцвечивании (фотоактивации) флуоресценции и дальнейшем наблюдении пространственного распределения сигнала во времени. Такой подход лежит в основе методов: FRAP (восстановление фотообесцвечиваня (СР - continuous photobleaching) или потери флуоресценции в процессе фотообесцвечивания (FLIP - Fluorescence Loss in Photobleaching) [129,130,131,132] и фотоактивации (PA - Photoactivation) [133]. Эти методы позволяют интерпретировать динамические измерения молекул с точки зрения химической кинетики.