WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 17 |

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

-- [ Страница 6 ] --

Вторая группа использует интенсивность флуктуации сигнала флуоресценции молекул, пребывающих и покидающих фокальный объём (для конфокального микроскопа). Во флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS - Fluorescence correlation spectroscopy) такие флуктуации оцениваются с помощью автокорреляционного анализа [134,135,136]. Третья группа основана на измерении транслокации индивидуальных частиц со временем [137,138]. Такие методы представляют собой прямой способ измерения диффузионного перемещения и взаимодействия с сайтами связывания интересующей молекулы. Однако, они зачастую ограничены относительно коротким периодом наблюдения ( 1 сек.), за который сигнал флуоресценции может быть зафиксирован и лишь небольшое количество траекторий записано для дальнейшего анализа.

Изменения, происходящие в клетках и их структурах во времени, можно исследовать и на обычных микроскопах, снабжённых видеосистемой. Но лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ) позволяет получать серии изображений с высоким пространственным разрешением [139]. Кроме того, благодаря наличию лазеров и системы сканирования можно осуществлять не только регистрацию временных изменений, но и осуществлять воздействие на клеточные структуры лазерным излучением. Быстродействие ЛСКМ определяется в основном сканирующей системой и колеблется от единиц до нескольких десятков тысяч кадров в минуту.

Частота кадров во многом определяется размерами кадра (т.е. числом точек сканирования - пикселов). Чем меньше размер кадра, тем большую скорость можно получить.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания) - метод применяется для измерения подвижности молекул посредством инициации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения.

После выжигания молекулы с флуорохромом из необесцвеченной области движутся посредством диффузии в обесцвеченную зону образца. По времени нарастания в ней флуоресценции можно судить о подвижности молекул (Рис. 6).

фотообесцвечивания (FRAP) является широко используемым подходом для исследования динамики макромолекул в живых клетках [128,127,140]. Этот метод широко используется для изучения многих аспектов клеточной биологии, включая скорости молекулярной диффузии и движения молекул, структуру хроматина [125], транскрипцию [141], мобильность мРНК [142], передачу сигналов [143], динамику цитоскелета [144], пузырьковый транспорт [145], клеточную адгезию [146] и митоз [147].

Хотя метод фотообесцвечивания используется с 1970-х годов [128,127,140], вновь возникший интерес к его применению обусловлен появление новых флуоресцентных меток, таких как, например, «зеленый флуоресцентный белок» (green fluorescent protein) GFP [129]. GFP хорошо подходит для FRAP исследований [148,149]. Это яркий, стабильный, нетоксичный флуорофор. При облучении высокой интенсивности, GFP необратимо обесцвечивается, не повреждая внутриклеточных структур [148, 149, 150, 151]. Важной особенностью GFP является то, что клетки могут синтезировать его сами.

GFP - меченым белкам могут быть доступны те внутриклеточные органеллы или их части, которые бывают недоступными в случае микроинъекций флуорофора в цитоплазму клетки. Это особенно ценно для клеточного ядра, которое только недавно стало предметом исследования подвижности эндогенных белков [152]. Таким образом, появление конфокальной микроскопии и GFP технологии привели к возрождению использования FRAP метода для изучения мобильности белков внутри живых клеток.

На практике, результаты FRAP анализа чаще всего являются качественными.

Обычно исследователи определяют следующее: подвижность белка, наличие неподвижной фракции белка, и как то или иное вещество влияет на мобильность белков [153]. Есть также эмпирические методы FRAP [154,155], которые основаны на идее, что если каждый образец исследовать при одинаковых экспериментальных условиях (например, использовать одинаковую интенсивность лазера, время обесцвечивания, и геометрию выжигаемой области), то относительный коэффициент диффузии может быть получен путем сравнения времён восстановления половины флуоресценции. На практике, однако, эти методы могут ввести в заблуждение при интерпретации кривых восстановления, т.к. восстановление фотообесцвечивания является сложным процессом, особенно в неоднородных средах.

Количественный анализ экспериментальных данных по FRAP, как правило, основан на аппроксимации экспериментальной кривой восстановления флуоресценции математического решения исходных дифференциальных уравнений (с несколькими переменными, в частных производных) в каждом конкретном случае с учетом начальных и граничных условий FRAP.

Несколько математических моделей были разработаны разными исследователями с целью извлечения количественных параметров из кривой FRAP, таких, как константы ассоциации и диссоциации, а также коэффициент эффективной диффузии. Среди них особо хочется выделить те, которые, были адресованы к следующим аспектам:

двумерная (2D) диффузия и одномерный поток для Гауссового и равномерного профилей пятен выжигания [127]; FRAP для Гауссова профиля пятна в случае второго порядка кинетики фотовыжигания; трехмерное (3D) расширение Гауссова [157] и равномерного [158] профилей пятен; численный подход для 2D [159,160] и 3D [161] FRAP; метод анализа распределения коэффициентов диффузии [162]; FRAP с использованием непрерывного фотообесцвечивания пятна, позволяющего вычислить диффузионное время и время нахождения на связывающих сайтах, для определения коэффициента диффузии [132]; метод определения кинетических констант в нестационарных условиях [163]; и реакционно-диффузионная модель FRAP, сформулированная в замкнутой форме аналитических выражений [164].

экспериментов - выжигание небольшой области (пятна) сфокусированным лучом лазера. Такие методики стали очень полезным инструментом для измерения поступательной подвижности молекул в микроскопическом масштабе. Однако, интенсивность флуоресценции выжженной области, информация о пространственном распределении интенсивности флуоресценции не может быть получена. Без такого пространственного разрешения невозможно проанализировать изменения пространственного распределения флуорофора в процессе восстановления. В современных видео-FRAP измерениях серия изображений, полученная после фотообесцвечивания, позволяет определять пространственный характер восстановления. Tsay было применено пространственное двумерное преобразование использовать все имеющиеся данные изображения для определения коэффициентов мобильности молекул [165], в дальнейшем этот метод был развит в работах Berk [166].

обесцвечивания. Ещё одним плюсом является то, что метод не зависит от геометрии области выжигания. Принципиальной особенностью метода Фурье является то, что коэффициент эффективной диффузии определяется в диффузионно-контролируемом процессе, что позволяет вычислить только отношение констант скорости ассоциации и диссоциации (т.е. константу равновесия), а не отдельно эти константы. Такая особенность не умаляет привлекательность метода, так как до настоящего времени основное практическое применение метода FRAP состояло в том, чтобы определить конденсированных средах. Но такие эксперименты должны проводиться в рамках связывания гораздо быстрее, чем время диффузии в обесцвеченную область. Поэтому, как уже отмечалось ранее [167], применимость диффузионно-доминирующей модели в каждом конкретном случае зависит от размера обесцвеченной области. С другой стороны, увеличение размера обесцвеченной области (что увеличивает время, необходимое для диффузии через обесцвеченную область) расширяет применимость такой модели для образцов с более медленными скоростями ассоциации. Метод Фурье экспериментальному шуму. В целях снижения уровня экспериментального шума, было предположено использовать самую низкую пространственную частоту преобразования Фурье [167]. Недавно было показано [168], что использование преобразования Ханкеля вместо преобразования Фурье также снижает уровень шума, что авторы объясняют компенсацией наблюдаемой временной зависимости фотобесцвечивания. Однако, как метод Фурье, так и метод Ханкеля были разработаны и обоснованы для однородных сред. Строго говоря, для этих методов до сих пор не получено кинетических уравнений в случае сильно неоднородных сред. Например, в случае однородной среды, применение этих методов даёт экспоненциальную зависимость от времени для кривой восстановления флуоресценции. В случае неоднородной среды зависимость функции восстановления флуоресценции от времени может существенно измениться. Это обстоятельство может привести к неправильным коэффициентам эффективной диффузии, полученным для неоднородных образцов.

Следует отметить, что большинство, если не все, количественные методы FRAP требуют использования математических решений соответствующих реакционнодиффузионных дифференциальных уравнений для оценки параметров (например, коэффициент диффузии). Это существенно снижает эффективность таких методов в сильно неоднородных средах, где математическое решение невозможно получить в случае неизвестного пространственного распределения сайтов связывания.

информативности измерения одиночных клеток за короткое время ее нахождения в зоне регистрации. Кроме того, существует проблема интерпретации кинетических измерений, проводимых в реальном времени на проточном цитометре, так как при этом разные клетки популяции измеряются в разное время и только однократно.

Для решения проблемы интерпретации данных кинетических измерений на проточном цитометре в 2000 году был разработан метод временной эволюции функций распределений для моделирования кинетики лиганд-рецепторного взаимодействия, однако, не был доведён до практического применения в случае обратимого лиганд – рецепторного взаимодействия. В данной работе предложено развитие такого метода для случая обратимого лиганд – рецепторного взаимодействия.

фотообесцвечивания (FRAP) является широко используемым подходом для исследования динамики молекул в живых клетках. Количественный анализ экспериментальных данных по FRAP, как правило, основан на аппроксимации экспериментальной кривой восстановления флуоресценции конкретной математической моделью. Такой подход требует знания математического решения исходных дифференциальных уравнений (с несколькими переменными, в частных производных) в каждом конкретном случае с учетом начальных и граничных условий FRAP. Однако, существует фундаментальная проблема применения такого подхода для неоднородных сред (например, ядер клеток), где получить соответствующее математическое решение практически невозможно в силу неизвестного неоднородного пространственного распределения сайтов связывания.

Альтернативный подход, развиваемый в данной работе, основан на новом методе обработки видео-FRAP измерений, разрешённых по пространственным координатам и по времени (получаемых с конфокального лазерного сканирующего микроскопа). При этом метод не требует знания соответствующего математического решения исходных дифференциальных уравнений, не зависит от геометрии области выжигания, профиля выжигающего луча лазера и пространственного распределения сайтов связывания.

Разделы “Структура хроматина. Краткое описание” и “Белок гетерохроматина HP1” Главы 1 частично написаны на основе следующего обзора:

E. Brtov, A. Harniarov Horkov, R. Uhlov, I. Raka, G. Galiov, D. Orlova, S.

Kozubek. Structure and epigenetics of nucleoli in comparison with non-nucleolar compartments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. Vol. 58(5), pp. 391 – 403, 2010.

Глава 2 Материалы и методы В этой главе кратко описаны экспериментальные установки, которые были использованы в данной работе. Также представлены методики кинетических экспериментов по исследованию лиганд-рецепторных взаимодействий и методика по выделению нейтрофилов из периферической крови.



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 17 |
 


Похожие материалы:

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.