WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 17 |

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

-- [ Страница 7 ] --

2.1. Сканирующий проточный цитометр Сканирующий проточный цитометр (СПЦ) позволяет измерять индикатрису светорассеяния, которая представляет собой зависимость интенсивности рассеянного света от угла рассеяния. Диапазон измеряемых углов в СПЦ составляет от 5° до 100°.

Технология сканирующей проточной цитометрии дополняется методами решения обратной задачи светорассеяния, которые позволяют получать информацию о морфологии клетки из индикатрисы светорассеяния. Таким образом, измерение и обработка индикатрис светорассеяния от клеток позволяет не только дифференцировать клетки крови, но и характеризовать эти клетки, а именно определять их размер, форму и структуру.

В качестве экспериментальной установки для определения дифференциального сечения рассеяния нейтрофила был использован сканирующий проточный цитометр (СПЦ) (Оптическая схема представлена на Рис. 7).

Его основные характеристики следующие:

1) индикатриса одиночной частицы измеряется в полярных углах от 5 до 1200 с интегрированием по азимутальному углу от 0 до 3600, 2) измерения, зависимостью от полярного угла, проводятся с использованием одного фотоприемника, 3) во время измерения частица движется в зоне постоянной освещенности.

СПЦ имеет оптическую систему, в которой свет, рассеянный одиночной частицей, сканируется по апертуре фотоприемника во время ее движения в потоке по капилляру кюветы. Схема кюветы представлена на Рис. 8. Поток, образованный гидрофокусирующей головкой, направляется в капилляр оптической кюветы (диаметр капилляра 0.254 мм, показатель преломления 1.458). Сферический рефлектор (радиус 3.0 мм) оптической кюветы направляет параллельные лучи на зеркало, расположенное под углом 45 градусов. При пересечении частицей триггерного луча (0 на Рис. 8) система измерения активируется по сигналу триггерного фотодиода. Для любого расположения частицы внутри измерительной зоны свет, рассеянный только под Рис. 7. Оптическая схема сканирующего проточного цитометра стандартной конфигурации.

определенным углом отразится сферическим зеркалом параллельно оси потока.

Например, углы 1 и 2 соответствуют точкам 1 и 2 соответственно (Рис. 8). Угол, образованный направлением падающего лазерного луча и рассеянным лучом, который отражается параллельно оси потока, непрерывно изменяется от 1 до 2 при движении частицы внутри зоны регистрации оптической кюветы. Параллельные лучи, Рис. 8. Упрощенная схема функционирования оптической кюветы. Основной и триггерный луч, а также лучи рассеяния показаны штриховыми линиями.

отраженные 45-градусной пластинкой, выходят из оптической кюветы и фокусируются напряжения на фотоумножителе от времени может быть легко преобразована в зависимость интенсивности светорассеяния от угла [169].

Основное излучение (диодный лазер, 660 нм, 20 мВт) (лазер 1,Рис. 7) распространяется вдоль оси канала, по которому движутся частицы, и фокусируется в кювету через оптическое окно в нижней части сканирующей оптической кюветы.

движущейся частицы во время измерения.

преобразователем (сигнал СПЦ), отличается от реальной индикатрисы вследствие искажения аппаратной функцией СПЦ. Угловое разрешение зависит от положения частицы в зоне регистрации. Для нормировки наблюдаемого сигнала использован аналитический вид аппаратной функции. Ее вид представлен формулой (1) настоящего раздела при = 0, = /f, где – диаметр диафрагмы фотоумножителя, f – фокусное расстояние линзы.

где H – расстояние от пролетающей частицы до диафрагмы фотоприёмника, n1 – показатель преломления кюветы (кварц), h – расстояние от сферического зеркала до Телесный угол,стерадианы края подложки.

Вид аппаратной функции представлен на Рис. 9.

2.2. Пробоподготовка нейтрофилов для измерения на СПЦ Для подготовки образцов нейтрофилов использовалась периферическая цельная кровь пациентов. Кровь забирали в 3 мл пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА).

Проведение эксперимента:

1. Забрать пипеткой 1.5 мл крови и перелить в отдельную пробирку;

2. Довести лизирующим раствором (BD Biosciences, FACS lysing solution) до объёма 15 мл;

3. Ждать около 2 минут;

4. Центрифугировать на 1500 оборотов/мин в течение 5 минут при комнатной температуре;

5. Аккуратно вылить жидкость из пробирки (желательно промокнуть горлышко салфеткой для уменьшения объёма и соответственного сокращения количества используемого красителя). Клетки останутся на дне.

6. Разболтать клетки, проведя несколько раз дном пробирки по ребристой поверхности;

7. Дополнить до 15 мл раствором Эрла (без фенолового красного);

8. Повторить пункты 4, 5.

9. Добавить 20 мкл ФИТЦ-меченых антител к CD16b (Immunotech, clone 3G8).

Нейтрофилы экспрессируют CD16b [170];

10. Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре для обеспечения равномерного прокрашивания клеток;

11. Повторить пункты 6, 7, 8;

Разбавить 1 мл раствора Эрла для получения рабочей концентрации 12.

клеток/мл;

13. Проба готова для измерения. Держать клетки в таком состоянии желательно не более 4-5 часов в холодильнике [171].

2.3. Проточный цитометр FACS Calibur В качестве экспериментальной установки для исследования лиганд-рецепторного взаимодействия на поверхности биологических клеток был использован проточный цитометр FACSCalibur, Becton Dickinson, USA. Оптическая схема прибора приведена на Рис. 10.

Основная идея проточных цитометров стандартной конфигурации заключается в измерении различных характеристик одиночных частиц. Для этого с помощью гидрофокусирующей головки (Рис. 11) создается два ламинарных коаксиальных потока - внутренний поток, имеющий диаметр порядка 10-30 мкм (представляет собой пробу с Рис. 10. (взято из [172]) Оптическая схема проточного цитометра FACSCalibur. Где BP – “band pass” - оптический полосовой фильтр, Light Scatter Diode - фотодиод для регистрации рассеяния вперед, Half Mirror - полупрозрачное зеркало, DM дифракционное зеркало, Beam Splitter делительная пластинка, LP - “low pass” оптический фильтр низких частот, SP - “short pass” - оптический фильтр высоких частот.

измеряемыми объектами), и внешний, который состоит из отфильтрованной воды. За счет малого сечения внутренней струи и ламинарности потока в рабочей зоне прибора создается возможность измерения характеристик одиночной частицы. При этом максимальная скорость измерений на проточных цитометрах достигает сотен тысяч частиц в минуту. Такие измерения свойств одиночных частиц, не требующие, каких либо предположений о характере распределения, позволяют легко отслеживать малые изменения во всей системе. С другой стороны, высокая скорость накопления данных позволяет измерять большое количество частиц, что дает высокую статистическую достоверность результатов.

Конструкция прибора предусматривает возможность установки 1-го или 2-х лазеров с разными длинами волн (например, 488 нм и 635 нм). Лазерное излучение фокусируется линзой в кювету. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют: светорассеяние вперёд (FCS) и светорассеяние вбок (используются для морфологической идентификации клеток), интенсивность флуоресценции по 4-м каналам флуоресценции (FL1-FL4).

2.4. Постановка кинетического эксперимента по исследованию поверхностных лиганд-рецепторных взаимодействий В данной работе in vitro исследовалась кинетика связывания моноклональных антител с поверхностными рецепторами FcRIIIb нейтрофилов человека. Перед каждым экспериментом гепаринизированная венозная кровь доноров отстаивалась в течение минут при 37°С для осаждения эритроцитарной массы. Все эксперименты проводились при комнатной температуре (+20оС). Из отстоявшейся крови лейковзвесь отбиралась и отмывалась PBS, содержащим 0.01% EDTA и 0.1% NaN3. Кинетика связывания измерялась следующим образом: 30 мкл клеточной суспензии (концентрация нейтрофилов 4-14·107 см-3) и 10 мкл раствора моноклональных IgM FITC-меченых антител к СD16b (Immunotech, clone 3G8) определённой концентрации (в диапазоне 0.1см-3) смешивались в пластиковой пробирке. Через определённый промежуток времени, пробирка помещалась в проточный цитометр FACS Calibur (Becton Dickinson, США). По интенсивности прямого и бокового светорассеивания на полученных цитограммах определяли область, соответствующую гранулоцитам. Из этой области выделяли субпопуляцию CD16b+, используя гистограмму распределения клеток по интенсивности флуоресценции флуорохрома FITC.

2.5. Основные компоненты конфокального микроскопа Leica TCS SP В качестве экспериментальной установки для исследования лиганд-рецепторного взаимодействия внутри ядер живых клеток был использован конфокальный лазерно – сканирующий микроскоп Leica TCS SP5.

Термин “конфокальная” означает “софокусная”. При этом в плоскости, оптически сопряженной с фокальной плоскостью объектива, находится конфокальная диафрагма, что позволяет регистрировать сигнал лишь от тонкого (по «глубине») слоя [173].

Оптический принцип конфокальной микроскопии схематично представлен на Рис. 12.

Наиболее часто встречающейся задачей для конфокальной микроскопии, благодаря ее высокому разрешению и контрасту, является изучение структуры клеток и их органелл, например, цитоскелета, ЭПР, лизосом, митохондрий, ядра, хромосом и даже генов. Исследуется также cо-локализация в клетке двух и более веществ. Еще одна задача – исследование динамических процессов, происходящих в живых клетках.

Например, клеточного транспорта биологически-активных соединений, изменений концентрации и распределения ионов кальция. Новыми перспективными направлениями являются методики FRAP – Fluorescence Recovery After Photobleaching (восстановление флуоресценции после фотоотбеливания) и FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer (флуоресцентный резонансный перенос энергии). FRAP применяется для исследования подвижности биологических молекул, FRET – для определения расстояния между молекулами разных типов, их окружения и взаимодействия.

ФЭУ ФЭУ

ТРис. 12 Принцип конфокальной фильтрации сигнала.

Луч лазера (непрерывная линия) с помощью селективного зеркала (СЗ) направляется в объектив микроскопа и фокусируется в точку Т0 в глубине исследуемого объекта. Флуоресценция, излучаемая из этой точки (прерывистая линия), собирается объективом и фокусируется линзой Л в сопряженной фокальной плоскости объектива, проходя через отверстие в конфокальной диафрагме (КД) к фотоэлектронному умножителю (ФЭУ) (а). Флуоресценция, излучаемая из точек Т+ (б) и Т_ (в), дефокусирована на КД и к ФЭУ не проникает. Тем самым обеспечивается подавление флуоресценции, испускаемой из точек образца, расположенных выше и ниже фокуса объектива, и улучшается разрешение вдоль оптической оси объектива.

Преимуществом инвертированного микроскопа перед прямым является то, что толщина исследуемого образца не ограничена рабочим расстоянием объектива.

Благодаря этому можно использовать специальную посуду, например, чашки Петри, планшеты или специальные кюветы. Это очень удобно при исследовании живых клеток, находящихся в питательной среде.

Рис. 13 Инвертированный микроскоп. (Leica Microsystems).

А – общий вид микроскопа: 1 – окуляр, 2 – передняя панель, 3 – экран, 4 – грубая и тонкая настройка фокуса, 5 – револьверная головка для объективов, 6 – конденсор, – основание конденсора, 8 – полевая диафрагма.

Б – панель управления освещением: INT –интенсивность освещения проходящим светом, AP – апертурная диафрагма, FD – полевая диафрагма, TL/IL – переключение из режима проходящего света в режим флуоресценции.



Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 17 |
 


Похожие материалы:

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.