WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |   ...   | 17 |

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

-- [ Страница 8 ] --

В – передняя панель: ) – 100% света в окуляры, I3, N2.1, A – флуоресцентные кубики (Таблица 2), Shutter – затвор.

Рассмотрим подробнее метод флуоресцентной микроскопии. При этом методе в оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра (объединены в специальный Таблица 2. Фильтр-кубики для флуоресценции.

блок – кубик) (Рис. 14). Первый светофильтр пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта, либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его фоточувствительный слой) только свет флуоресценции. В инвертированном микроскопе препарат освещается через объектив, который в этом случае служит и конденсором. Наблюдение при освещении через объектив иногда называют «флуоресцентной микроскопией в отражённом свете»; этот термин условен – возбуждение свечения препарата не является простым отражением света.

Рис. 14 Схематичное изображение фильтр – кубика для флуоресценции.

BP – band pass filter – фильтр с указанной полосой пропускания.

LP – long pass filter – фильтр, пропускающий весь свет после указанной в маркировке длины волны.

В системе Leica TCS SP лазерный модуль встроен в системный блок компьютера.

Световые пучки от разных (405, 488, 532 и 635 нм и т.д.) лазеров (1) с помощью системы зеркал (2) сводятся в один соосный пучок и через акустооптический перестраиваемый фильтр АОПФ (3) заводятся в оптическую систему микроскопа (Рис.

15А). Акустооптический фильтр за счет быстро-изменяемой пропускающей способности на заданных длинах волн пропускает в микроскоп только то лазерное излучение, которое используется в данный момент для возбуждения флуоресценции, блокируя свет на остальных длинах волн лазера. Также АОПФ позволяет быстро и точно изменять интенсивность возбуждающего света.

Рис. 15 А – сканирующая головка и системный блок со встроенным лазерным модулем: 1 – лазеры, 2 – система зеркал, 3 – АОПФ, 4 –светоделительное устройство, – система зеркал-сканеров, 6 – объектив, 7 – детектор проходящего света, 8 – конфокальная диафрагма, 9 – призма, 10 – щель (шторки), 11 – коллиматор, 12 – ФЭУ.

Б – спектральный принцип выделения измеряемого сигнала. (Leica Microsystems).

Светоделительное устройство (4) эффективно подавляет свет на длине волны генерации лазера и пропускает через себя остальной свет. Это позволяет завести лазерный луч в объектив (6), а также с минимальными потерями пропустить собранный объективом флуоресцентный сигнал к системе детекции. Луч лазера проходит через объектив и фокусируется в заданную точку образца. С помощью системы из двух зеркал-сканеров (5) лазерный луч перемещается от точки к точке в плоскости препарата XY. Испускаемый образцом флуоресцентный сигнал собирается тем же объективом, а затем через конфокальную диафрагму (8) и спектральную оптическую схему направляется на детектор - фотоэлектронный умножитель ФЭУ (12).

Конфокальная диафрагма (8) помещается в сопряженной фокальной плоскости объектива, точнее, в той плоскости, где микроскоп фокусирует сигнал, собранный из фокуса объектива. В этом случае через диафрагму пройдет только та флуоресценция, которая испускается из небольшого объема вблизи фокуса лазерного луча под объективом. Сигналы, идущие от слоев выше и ниже фокуса, оказываются дефокусированными на конфокальной диафрагме и через нее к ФЭУ не проникают.

Диаметр конфокальной диафрагмы можно варьировать, тем самым, изменяя толщину оптического слоя вблизи фокуса объектива, от которого измеряется сигнал.

Фирма Leica в лазерных сканирующих конфокальных микроскопах серии TCS SP полностью отказалась от использования оптических фильтров для селекции сигнала, построив оптическую схему на спектральном принципе (Рис. 15Б). Флуоресцентный сигнал, прошедший через конфокальную диафрагму разлагается призмой (9) в спектр.

Часть спектра направляется на ФЭУ (12) через щель (10). Ширина щели регулируется, что выполняет функцию фильтров, перестраиваемых по ширине и диапазону длин волн пропускания. Предельное спектральное разрешение этого прибора составляет 5 нм.

2.6. Постановка кинетического эксперимента по исследованию внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий 2.6.1. Плазмиды Плазмиды, содержащие генетический код белков GFP-HP1, GFP-HP1 и GFPHP1, - щедрый подарок д-ра Тома Мистели (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Генетические конструкции были использованы для трансформирования подготовленных соответствующим образом E.coli DH5a. ДНК плазмид были выделены, используя набор Qiagen Large-Construct kit (catalogue No. 12462; Qiagen, Bio-Consult, Bozejovicka, Czech Republic).

2.6.2. Клеточные культуры и трансфекция В качестве экспериментальных клеточных культур использовали эмбриональные мышиные фибробласты (MEFs) от дикого типа мышей (wt) и от нокаутного по обоим метилтрансферазам (HMTs) Suv39h1 и Suv39h2 (Suv39h1/2-/- мыши) типа мышей.

Иммортализованная линия клеток Suv39h1/2-/- MEFs была щедро предоставлена профессором Томасом Янувейном (Max-Planck Institute of Immunobiology, Freiburg, Germany). Иммортализованные MEFs из мышиных гомозигот нокаутных по гену ламин A-тип (Lmna-/- мыши) и соответствующие дикие типы (wt) MEFs – щедрый подарок дра Терезы Салливан и профессора Коллина Л. Стюарта. MEFs выращивали до 70% плотности на чашке Петри (со стеклом для микроскопических исследований на дне) с использование питательной среды DMEM с высоким содержанием глюкозы, а также, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мг/мл). Клеточную культуру выращивали при температуре 37С и при 5% содержании CO2 в воздухе.

Для измерения мобильности белков была проведена трансфекция клеток векторами, экспрессирующими GFP меченые белки HP1 (a, b, g), используя реагент для трансфекции METAFECTENE EASY (Biontex, Мюнхен, Германия), так как описано в инструкции от производителя. После проведения процедуры трансфекции, для экспрессии белка HP1-GFP, клетки инкубировали в течении 20 часов при температуре 37С и при содержании 5% CO2 в воздухе.

2.6.3. Тестовый раствор Для проверки нового FRAP метода на простейшем случае была использована однородная среда без сайтов связывания - сывороточный альбумин (FITC-HSА, 1.5: степень модификации) в концентрации около одного мкмоль/л в смеси глицерин/вода (80% по весу, фосфатно-солевой буфер 0.05 М, рН 8). Глицерин был добавлен в воду, чтобы достичь требуемого диапазона коэффициентов диффузии; 5 мл приготовленного образца было помещено на стекло, накрыто покровным стеклом размером 24х24 мм и залито парафином по краям. Таким образом, толщина измеряемого объекта была ~ мм. Эксперименты были проведены в течение одного часа после приготовления.

2.6.4. FRAP-протокол FRAP эксперименты проводили на лазерном сканирующем микроскопе Leica TCS SP5X (Leica, Германия): объектив 63/1.4 NA масляный иммерсионный, диаметр пинхола 1 Эйри (оптическое разрешение 0.17 мкм, разрешение по оси z 0.5 мкм).

Фотообесцвечивание было сделано с помощью 30-мВт аргонового лазера при длинах волн 476, 488, и 514 нм. В отличие от стандартных FRAP методов, была обесцвечена большая область (примерно половина) ядра клетки. Восстановление флуоресценции было записано примерно в течение 20 секунд после обесцвечивания с интервалом между кадрами в 1 секунду. Используемое разрешение 512 512 пиксель, лазер для наблюдения: 40-мВ “белый” лазер (при 10% от общей мощности) при длине волны нм.

Глава 3 Исследование поверхностных лиганд-рецепторных взаимодействий В этой главе в разделе “Теория” представлена разработанная ранее модель связывания растворенных лигандов с клеткой, учитывающая гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов и описывающая процесс через состояния клетки.

Эта модель позволяет описать кинетику не только средних величин, но и самой функции распределения по количеству рецепторов, которая может быть измерена непосредственно в ходе эксперимента. В разделе “результаты” продемонстрировано применение математической модели в случае обратимого лиганд – рецепторного взаимодействия для описания экспериментальных данных, получаемых во время цитофлуориметрических измерений. В данной работе впервые была применена такая математическая модель для обработки кинетики лиганд – рецепторного связывания в случае низкоаффинных рецепторов, для которых наличие реакции диссоциации не может быть проигнорировано.

3.1. Теория 3.1.1 Формулировка физической модели Ранее [53] было предложено использовать следующую модель для описания процесса лиганд – рецепторного взаимодействия: будем рассматривать клетку как твердый сферический объект радиуса R (характерное значение R~5мкм). Лиганды растворены в среде с вязкостью и могут обратимо связываться с поверхностными рецепторами клеток. Сами рецепторы будем рассматривать как одновалентные посадочные места площади s на поверхности клетки. Тогда между рецептором и лигандом может образоваться только одна связь.

Будем предполагать, что рецепторы взаимодействуют с лигандами независимо друг от друга, а их общее число (занятых и свободных) сохраняется в течение всего процесса. Тем самым мы не рассматриваем здесь такие процессы, как эндо- и экзоцитоз, изменяющие количество рецепторов на поверхности клетки.

3.1.2. Кинетическая схема процесса лиганд-рецепторного связывания Рассмотрим клетку, на поверхности которой имеется n посадочных мест для связывания. При связывании одной молекулы растворенного лиганда с клеткой появляется один комплекс лиганд-рецептор, а количество свободных посадочных мест уменьшается на один и становится равным n-1. Следующая молекула лиганда, связавшаяся с клеткой, увеличивает количество комплексов еще на единицу и уменьшает количество посадочных мест также на единицу. Таким образом, если есть только клетки с n рецепторами на поверхности, процесс связывания растворенного лиганда с клеткой может быть представлен формально как серия последовательных реакций между лигандом и клеткой:

Здесь L означает растворенный лиганд, Сx,y соответствует клетке с х «свободными» и у скорости реакции для связывания растворенного лиганда с клеткой и диссоциации лиганд-рецепторного комплекса для клетки, на которой х «свободных» и у «занятых»

рецепторов. Понятно, что в общем случае эти константы должны зависеть от количества занятых и свободных рецепторов на клетке.

Таким образом, мы перешли от описания процесса в терминах состояний лиганда, который обычно используется при описании процесса связывания лиганда с рецептором, к описанию в базисе состояний клетки. При таком подходе мы вместо реакции «растворенный лиганд» – «рецептор на поверхности» рассматриваем реакцию «растворенный лиганд» – «клетка в растворе». Для описания процесса связывания через состояния лиганда кинетическая схема выглядела бы более привычным образом [5,6]:

где L также означает лиганд, R – рецептор на поверхности клетки, а k +, k кинетические константы взаимодействия лиганда с рецептором. Такой переход позволяет описать процесс связывания с другой точки зрения, что, в конечном счете, и позволяет решить поставленную задачу.

Поскольку рецепторы не исчезают и не появляются, то, очевидно, что для одной клетки с n рецепторами выполняются следующие законы сохранения общего количества лигандов (LT) и рецепторов (n):

Теперь для кинетической схемы (3) можно, опираясь на закон действующих масс, выписать систему дифференциальных уравнений:

Эта система описывает временную эволюцию процесса связывания через количество клеток в соответствующем состоянии, то есть Сx,y будут в этом случае функциями времени Сx,y(t). Количество уравнений в этой системе соответствует общему количеству рецепторов на поверхности клеток и равно n+2 (включая уравнение на расход растворенного свободного лиганда). Обычно количество рецепторов, с которыми приходится сталкиваться исследователю, находится в пределах от 104 до 106.



Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |   ...   | 17 |
 


Похожие материалы:

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.