WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 17 |

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

-- [ Страница 9 ] --

Однако сложность решения такой системы будет заключаться не только в количестве уравнений, но и в задании начальных условий.

Вышеприведенные рассуждения подходят для случая, когда все клетки имеют одно и то же количество рецепторов. Но в действительности их количество различно для различных клеток даже для одной и той же клеточной линии. Поэтому уместнее говорить о распределении клеток по количеству рецепторов C n. Функция C n имеет простой физический смысл - это количество клеток с n рецепторами на поверхности в единице объема. При таком подходе и Cx,y в уравнениях (7) являются функцией распределения с аналогичным смыслом (а также и функциями времени, как указано выше). Cx,y(t) - это количество клеток с x свободными посадочными местами и y занятыми посадочными местами в единице объема в момент времени t. А сами уравнения (7) задают временную эволюцию этой функции распределения с начальными условием C x, y (0) = C x + y 0, y. В таком случае закон сохранения (6) превращается в интегральный закон сохранения:

Отметим, что функция распределения клеток по количеству рецепторов нормирована на общее количество клеток в единице объема - c:

3.1.3. Приближение непрерывной функции распределения Поскольку количество рецепторов на поверхности велико, а за один акт количество занятых и свободных рецепторов меняется на единицу, можно приближенно рассматривать C(n) как непрерывную функцию от непрерывной переменной n. Тогда, используя это приближение для функции Cx,y(t), можно ее рассматривать как непрерывную функцию от трех переменных C(x,y,t). При этом надо помнить, что константы скоростей k +, y, k x, y, так как мы их определили в (7), вообще говоря, тоже зависят от количества занятых y и свободных x посадочных мест на клетке, и, следовательно, при переходе к непрерывным функциям распределения также являются непрерывными функциями этих переменных k + ( x, y ) и k ( x, y ). Для рецепторов и лигандов примут интегральный вид:

концентрацию клеток С учетом нормировки из определения функции распределения, очевидно, следует следующая связь с полной концентрацией занятых (Y) и свободных (X) посадочных мест в реакционном объеме:

Для непрерывной функции распределения процесс связывания растворенного лиганда с клеточными рецепторами можно описать с помощью всего двух кинетических уравнений:

Уравнения (13)-(14) можно получить двумя способами. Первый, приближенный, состоит в замене конечной разницы для дискретной функции распределения в кинетическом уравнении для реакции (7) на частную производную от непрерывной функции распределения, используя определение производной. Второй способ состоит в непрерывной функции распределения C(x,y,t). Важно, что оба способа приводят к одинаковому результату.

Таким образом, решение задачи о связывании свелась к решению уравнений в частных производных (13)-(14). Уравнение (13) описывает временную эволюцию функции распределения по занятым и посадочным местам C(x,y,t). Необходимым условием решения системы (13)-(14) является задание начального условия в виде распределения C(n). Естественно, это в случае, когда в начальный момент все рецепторы свободны, иначе начальное условие будет выглядеть более сложно.

Поскольку на самом деле константы скоростей прямой и обратной реакций k + ( x, y ) и k ( x, y ) являются функциями числа посадочных мест, другим необходимым условием решения является знание конкретной зависимости констант скоростей от числа занятых и свободных посадочных мест.

3.1.4. Зависимость констант скоростей реакции от количества посадочных мест Реакции антиген-антитело, несмотря на отсутствие энергетического барьера, как правило, протекают со скоростями значительно меньше диффузионных в силу малости стерического фактора. Поэтому для их описания можно применить теорию контактных реакций между реакционно анизотропными частицами. Предполагая, что реакции на разных рецепторах клетки идут независимо, можно представить константу скорости прямой реакции в следующем виде [174]:

где x – количество свободных рецепторов на клетке, kD - константа скорости стационарной диффузии молекул антител к клетке, k+ – константа скорости прямой реакции на одном рецепторе. Таким образом, константа скорости прямой реакции пропорциональна количеству свободных рецепторов на поверхности клетки. Так как реакции на разных рецепторах клетки идут независимо, то вероятность распасться в единицу времени одному комплексу лиганд-рецептор пропорциональна общему количеству таких комплексов на поверхности данной клетки, то есть константа скорости обратной реакции пропорциональна количеству занятых рецепторов:

3.1.5. Распределение клеток по количеству занятых рецепторов В эксперименте можно детектировать распределение клеток по количеству занятых посадочных мест. При этом измеряется следующая величина:

Мы полагаем, что в начальный момент времени все лиганды находятся в растворенном состоянии, а все клеточные рецепторы свободны:

В этом уравнении мы использовали обозначение C ( x,0) для начального распределения по количеству свободных рецепторов:

Решение уравнений (13) и (14) в случае пропорциональности константы скорости числу рецепторов (15), (16) приведено в статье [53]:

квадратного уравнения Уравнения (20) описывают изменение экспериментально наблюдаемой величины в ходе кинетического эксперимента c учётом обратной реакции. Прямое применение уравнений для обработки экспериментальных данных чрезвычайно трудоёмко в силу своей математической сложности.

В данной работе применён следующий метод упрощения уравнений (20) для практического использования. Как видно из уравнений (20):

Используя уравнения (21), можно записать следующие преобразования для кинетики среднего:

где y - среднее число занятых рецепторов на клетке, N - среднее число рецепторов на клетке. Среднее число занятых рецепторов на клетке, y (t ), выражается следующим образом:

Где с – концентрация клеток, а LR - объемная концентрация лиганд-рецепторных комплексов в среде. Уравнение (4) сводится к виду:

для которого решение относительно t выглядит следующим образом:

Где R0 -полное число рецепторов в единице объёма (свободные и занятые), L0 концентрация антител, K – константа равновесия реакции.

Видно, что C ( y, t ) подобно начальному распределению клеток по свободным рецепторам C ( x,0), что в силу начального условия (18) означает подобие распределению клеток по полному количеству рецепторов. Поскольку распределение клеток по полному количеству рецепторов является неизвестным (часто именно оно и является целью исследования), саму функцию распределения искали в процедуре нелинейной регрессии. Для этого представляли теоретическую функцию распределения в дискретном виде C ( xi,0) (в виде вектора искомых параметров), которая определяла теоретическую кинетику функции распределения C ( yi, t ) по формуле (21). Применяя метод нелинейной регрессии, при сравнении теоретической и экспериментальной C ( y i, t ), методом наименьших квадратов мы получали наилучшие параметры, определяющие искомую функцию распределения C ( xi,0).

В данной работе уравнение (25) впервые было применено для математической обработки кинетики обратимого лиганд – рецепторного связывания.

3.2. Результаты В проточной цитометрии клетки разделяют по интенсивности прямого и бокового светорассеивания, а также по флуоресценции специфических маркёров на их поверхности. Для эффективного разделения клеток по светорассеянию необходимо использовать адекватную оптическую модель конкретной клетки, в частности для учёта её абсолютного сечения светорассеяния.

3.2.1. Определение абсолютного дифференциального сечения светорассеяния нейтрофила 3.2.1.1. Чувствительность и разрешающая способность СПЦ Определим диапазон углов, в которых представляется возможным измерять минимального угла вносят геометрические параметры кюветы. Минимальный угол для оптической модели нейтрофила.

измерения при параметрах цитометра d =254 мкм и l =5 мм - =1.5 [175].

Ограничения для максимального угла измерения индикатрисы составляет паразитный фон, который в эксперименте составлял 10% от максимального пика сигнала (Рис. 17). Индикатриса светорассеяния теоретически может быть представлена через элементы матрицы Мюллера. С учетом особенности оптической системы СПЦ, измеряемую комбинацию элементов матрицы Мюллера необходимо проинтегрировать по азимутальному углу для неполяризованного света. Матрица Мюллера, или матрица рассеяния, связывает параметры Стокса для падающего и рассеянного света [176]. В случае падения на частицу неполяризованного света интенсивностью I i, интенсивность рассеянного света равна рассчитанный для оптической модели нейтрофила представлен на Рис. 16. Сама модель Рис. 17 Регистрируемый на СПЦ сигнал светорассеяния от нейтрофила будет рассмотрена ниже.

Чтобы найти число фотонов, собираемых фотодиодом в единицу времени, оценим сначала энергию светорассеяния. В нашем случае, интенсивность рассеянного света равна:

Мощность падающего излучения P= 40 мВт, время облучения нейтрофила =0.2 мкс.

Сечение пучка лазера = 4 D 2 составляло 27·10-11м. D – ширина перетяжки расстояние линзы 45 мм, d- радиус пучка на выходе из лазера 2 мм.

Энергия рассеянного света выражается по формуле (27):

здесь = r 2 sin - поверхность сбора рассеянного света. Подставляя в где J- проинтегрированный по телесному углу 2 sin() (Рис. 9) элемент S11 ( ).

Подставляя численные значения величин в формулу (28), и оставляя за варьируемый параметр J, получим:

Количество квантов N, собираемых фотоприемником:

где h -постоянная Планка 6.626 · 10-34 Дж·с, c –скорость света 3.0 · 108 м/с.

Используя выражение (29), представим (30) в следующем виде:

проинтегрированный по телесному углу элемент S11 ( ) :

Это выражение с учетом аппаратной функции (1) и (2) можно преобразовать к виду:

Таким образом, учитывая формулу (33), находим число фотонов по формуле (31) (Рис. 18).

Найдем углы, при которых шумы сравнимы с количеством рассеянных возбуждающего излучения и флуоресценции потока частиц, в основном результат того, что эмиссия света случайный процесс. Число фотонов, достигающих фотодетектор, подчиняется статистике Пуассона, если имеется источник фотонов, дающий в среднем N фот/сек., то вероятность регистрации n квантов за время t подчиняется статистике Количество фотонов в единицу времени, шт/сек.

Рис. 18. Количество квантов, собираемых фотодетектором Пуассона.

среднеквадратичные флуктуации потока равны мощности источника фотонов n = N. Это выражение описывает так называемый фотонный шум.

В проточной цитометрии сигнал N состоит из двух компонент:

1. сигнал светорассеяния от нейтрофила, имеющий nf фотонов, 2. фоновый сигнал, nb, вызванный в основном рассеянием на потоке частиц и Следовательно, суммарная интенсивность, попадающая на фотокатод, есть nf+nb.

Далее, попав на фотокатод, фотоны выбивают электроны из фотокатода. Это тоже случайный процесс и количество фотоэлектронов изменяется согласно распределению Пуассона. Следовательно, относительное стандартное отклонение сигнала с фотокатода ФЭУ будет:

где e = (0.05) фотоэлектронная квантовая эффективность ФЭУ - вероятность что фотон, попадая на фотокатод, выбьет фотоэлектрон.

В итоге, максимальный угол находится из условия, что рассеяние от нейтрофила, собранное под этим углом и падающее на фотокатод, сравнимо с шумами.



Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 17 |
 


Похожие материалы:

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»

« Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….….4 ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ, РАЙОН РАБОТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………….…………………………….…………….….9 1.1. История изучения фауны Центрального ...»

« ТОКРАНОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ ДОННЫХ И ПРИДОННЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫХ СЕМЕЙСТВ В ПРИКАМЧАТСКИХ ВОДАХ 03.00.10 – ихтиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Петропавловск-Камчатский – 2009 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Черешнев Игорь Александрович доктор биологических наук Долганов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Шунтов Вячеслав Петрович ...»







 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.