Ульянова онега владимировна методология повышения безопасности бактериальных вакцин на модели вакцинных штаммов brucella abortus 19 ba, francisella tularensis 15 нииэг, yersinia
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИМЕНИ Н.И. ВАВИЛОВА
На правах рукописи
Ульянова Онега Владимировна
МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ
BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ,
YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ
03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Фёдорова Валентина Анатольевна Саратов –
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………….…………………….ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. Современное состояние вакцинопрофилактики бруцеллеза, туляремии, чумы ………………………………………………………………… 1.1. Классификация вакцин против бактериальных инфекций…….….. 1.2. Состояние проблемы вакцинопрофилактики бруцеллеза, туляремии и чумы…………………………………………………….….… 1.3. Способы повышения безопасности вакцин против бруцеллеза, туляремии и чумы………………………………..………………………… 1.4. Оценка безопасности живых вакцин…………………………………СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………… 2.1. Объекты исследования..………………………………….…………… 2.2. Методы оценки жизнеспособности, культуральноморфологических и серологических свойств бактерий…………………. 2.3. Оценка безопасности вакцинных штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ и B. abortus 19 BA по определению остаточной вирулентности, безвредности и реактогенности in vivo…………………………………… 2.4. Оборудование, реактивы и материалы……………………………… 2.5. Лабораторные животные………………..…………………………… 2.6. Статистические методы……………….………………………………ГЛАВА 3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИЙ ESCHERIСHIA COLI И
PSEUDOMONAS AERUGINOSA РАЗНЫХ ШТАММОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ И
ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИЙ ИНАКТИВАЦИИ МЕТОДОМ
ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ……………………………….…. 3.1. Выбор бактериальных штаммов, фотосенсибилизатора и длины волны облучения для проведения модельных экспериментов………... 3.2. Разработка установки для инактивации бактерий методом фотодинамического воздействия in vitro………………....……………… 3.3. Влияние различных концентраций метиленового синего на колониеобразующую способность бактерий spp. и E. coli P. aeruginosa spp3.4. Влияние на колониеобразующую способность бактерий E. coli spp.
и P. aeruginosa spp. красного излучения разных источников…………. 3.5. Влияние на колониеобразующую способность бактерий E. coli spp.
и P. aeruginosa spp. фотодинамического воздействия………………… 3.6. Оптимизация условий инактивации бактерий E. coli spp. и spp. методом фотодинамического воздействия P. aeruginosa (математическое моделирование)……………………………………….. 3.7. Колониеобразующая способность и культуральноморфологические свойства бактерий E. coli spp. и P. aeruginosa spp.
после проведения инактивации методом фотодинамического воздействия……………………………………………………………….....
ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ
BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ И
YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ ПОСЛЕ ИНАКТИВАЦИИ МЕТОДОМ
ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ…………………………..……… 4.1. Характеристика культурально-морфологических, биохимических и серологических свойств бактерий вакцинного штамма B. abortus BA после инактивации……………………………………………...……... 4.2. Характеристика культурально-морфологических, биохимических и серологических свойств бактерий вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ после инактивации………………………………………..… 4.3. Характеристика культурально-морфологических, биохимических и серологических свойств бактерий вакцинного штамма Y. pestis EVГЛАВА 5. ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ
BRUCELLA ABORTUS 19 BA И FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ ДО
И ПОСЛЕ ИНАКТИВАЦИИ МЕТОДОМ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО
ВОЗДЕЙСТВИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ НА МОРСКИХ СВИНКАХ……….. 5.1. Определение безвредности, остаточной вирулентности и реактогенности вакцинного штамма B. abortus 19 BA до и после 5.2. Определение безвредности, остаточной вирулентности и реактогенности вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ до и после экспериментах на морских свинках………………………………………. 5.3. Определение реактогенности вакцинных штаммов B. abortus BA и F. tularensis 15 НИИЭГ когерентно-оптическими методами в 5.3.1. Разработка научно-методических основ применения 5.3.2. Разработка и создание экспериментальной диагностической штаммов на организменном уровне, основанной на спеклимиджинге…………………………………………………………….. 5.3.3. Разработка и создание экспериментальной диагностической биосистемы для определения реактогенности вакцинных штаммов на тканевом уровне, основанной на спекл-микроскопии…………….. ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………..………………….. ВЫВОДЫ………………………………………………………..………………… СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ………………………….. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………...ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. В настоящее время специфическая профилактика таких зоонозов, как бруцеллез, туляремия и чума является актуальной, что обусловлено длительным существованием обширных природных очагов в РФ и сопредельных странах, наличием локальных эпизоотий, ростом заболеваемости в мире. Эти инфекции считаются социально значимыми, наносящими значительный экономический ущерб, который угрожает стабильности мирового сообщества (Олсуфьев, 1970; Руководство по профилактике чумы, 1992; Домарадский, 1993;Онищенко, 2001; Мещерякова и др. 2006, 2011; Скляров и др., 2008; Онищенко, Кутырев, 2009; Мировая статистика здравоохранения ВОЗ, 2010; Кутырев и др., 2011; Инфекционная заболеваемость в РФ, 2013; Лямкин и др., 2013; Попов и др., 2013; Levesque et al., 1995; Helvaci et al., 2000; Wicki et al., 2000; Boschiroli et al., 2001; Reintjes et al., 2002; Corbel, Feodorova, 2011; Feodorova, Motin, 2011, 2012).
Cпецифическая профилактика бруцеллеза, туляремии и чумы более 60 лет заболеваемости, снижению смертности в послевоенные годы прошлого столетия и спасению сотен тысяч жизней. Однако за длительный период использования живых вакцин выявлен ряд недостатков, связанных с проявлениями реактогенности штаммовпродуцентов B. abortus 19 BA и Y. pestis EV (Наумов и др., 1992; Волох и др., 2013;
Meyer et. al., 1974; Perry, Fetherston, 1997); случаями возникновения поствакцинального бруцеллеза (Вершилова и др., 1975; Наумов, Самойлова, 1992; Книрель и др., 2011);
обнаружением антител в крови сельскохозяйственных животных после введения B. abortus 19 BA (в таком же титре, как и у больных), что затрудняло определение эпизоотического статуса животных по бруцеллезу (Глонти, 1973; Григорьева, Улицкая, 1990; Ляпина, 2004; Berman et al., 1980). При массовой иммунизации населения туляремийной вакциной были зарегистрированы случаи осложнений. Следует отметить также снижение иммуногенных свойств вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, что происходило в результате потенциальной диссоциации данных бактерий в авирулентную для лабораторных животных R-форму, и это в свою очередь приводило к утрате способности формировать у человека длительный напряженный иммунитет против вирулентных штаммов туляремии (Олсуфьев, Дунаева, 1970; Горькова и др., 1981; Анисимова и др., 1982; Самойлова и др., 1987; Кисличкин, 2007; Gese, 1997).
Кроме того, риск завоза и распространения инфекций связан с проведением массовых спортивных мероприятий, развитием культурных и экономических межгосударственных связей, миграционными процессами, нередко вызванными военными конфликтами. Следует учитывать также, что возбудителей бруцеллеза, туляремии и чумы рассматривают во всем мире как потенциальных агентов для создания биологического оружия. Однако не меньшую угрозу представляют антропогенная трансформация ландшафтов природных очагов; природные и техногенные катастрофы; изменение климата, разрушение скотомогильников и рост эпизоотий (Денисов, 1983; Дятлов, 2002; Домнин, 2004; Онищенко, 2010; Удовиков, 2010).
Таким образом, для более широкого и массового проведения профилактических прививок населения и сельскохозяйственных животных необходимым считается повышение безопасности живых вакцин против бруцеллеза, туляремии и чумы (Руководство по профилактике чумы, 1992; Воробьев, 2002; Алексеев и др., 2003;
Онищенко и др., 2007; Письмо ФС, 2007; Хаитов и др., 2007; Приказ ФС № 152, 2008; Удовиченко и др., 2013; Ales, Katial, 2004; Conlan, 2004; Gallagher-Smith et al., 2004; Corbel, Feodorova, 2011).
Степень разработанности проблемы В России и СНГ вакцину из штамма Brucella abortus 19 BA применяют для профилактики бруцеллеза сельскохозяйственных животных (с 1952 г.) и людей (с г.) (Вершилова, 1960; Шумилов и др., 1984; Corbel, Feodorova, 2011); вакциной из штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ проводят иммунизацию против туляремии с 1946 г. (Олсуфьев, Дунаева, 1970); живую вакцину из штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ для профилактики чумы используют с 1942 г. (Коробкова, 1956; 1970; Домарадский, 1993; Супотницкий и др., 2006; Anisimov et al., 2004; Feodorova, Corbel, 2009; Feodorova, Motin, 2011). В Европе, США и Канаде для профилактики туляремии длительное время (более 30 лет) использовали дериват «родительского» штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, живую вакцину F. tularensis LVS, доказавшую свою эффективность и безопасность для привитых людей (Gese et al., 1997; Ellis et al., 2002). Высокая эффективность живых вакцин из штаммов B. abortus 19 ВА и В. abortus RB51 была зарегистрирована в США при иммунизации крупного рогатого скота и диких животных (Olsen, Mamer, 2005;
Denisov et al., 2010). Вместе с тем, для профилактики чумы в США, Европе и Австралии с 1946 по 1998 г. использовали только убитую USP вакцину, так как иммунизация некоторых биомоделей (none-human primates) живой вакциной на основе парентального штамма Y. pestis EV76 сопровождалась летальной чумой (Meyer, 1970). Следует отметить, что случаев реверсии вирулентности среди привитых людей за всю историю применения живых вакцин B. abortus 19, F. tularensis 15 НИИЭГ, Y. pestis EV НИИЭГ не наблюдалось.
Несмотря на это, современные исследования многих ученых мира направлены на создание безопасных вакцин, не содержащих живые микробные клетки (Домарадский, 1993; Хлебников и др., 1994; Жемчугов и др., 2004; Книрель и др., 2011; Волох и др., 2013; Fulop et al., 2001; Winter et al., 2002; Anisimov et al., 2004; Conlan, 2004; Goodin et al., 2005; Feodorova, Corbel, 2009; Feodorova, Motin, 2011, 2012). К таким вакцинам относятся химические, субъединичные, рекомбинантные и др. О создании лицензированных сельскохозяйственных животных и людей против бруцеллеза, туляремии и чумы, которые превосходили бы по иммуногенным свойствам известные лицензионные живые вакцины B. abortus 19 BA, F. tularensis 15 НИИЭГ и Y. pestis EV НИИЭГ, до начала наших исследований не сообщалось. Пока обнадеживающие результаты в этом направлении достигнуты только в экспериментах на лабораторных животных (Олсуфьев, 1970; Домарадский, 1993; Селиверстов, Шумилов, 2001; Сафина и др., 2004;
Иванов и др., 2006; Шумилов и др., 2008; Кисличкин, 2007; Салмакова, 2010; Книрель и др., 2011; Anisimov et al., 2004; Corbel, Feodorova, 2009, 2011; Feodorova, Motin, 2011, 2012). Так, против бруцеллеза, туляремии и чумы были предложены убитые вакцины (Домарадский, 1993; Медуницын, 2004; Книрель и др., 2011; Петров, Хаитов, 2011;
«