WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS


Pages:     | 1 |   ...   | 11 | 12 || 14 | 15 |   ...   | 31 |

Ульянова онега владимировна методология повышения безопасности бактериальных вакцин на модели вакцинных штаммов brucella abortus 19 ba, francisella tularensis 15 нииэг, yersinia

-- [ Страница 13 ] --

Рисунок 1 — Изучение типичных культурально-морфологических свойств штамма E. coli В6: а – морфология и размеры клеток, б – рост в ГРМ бульоне, в – колонии на Таблица 1 – Изучение биохимических свойств разных штаммов бактерий E. coli и P. aeruginosa Вид бактерий Штамм бактерий Примечание: к – кислота, г – газ, «+» - наличие признака, «–» – отсутствие признака, «±» – признак слабо выражен.

Рисунок 2 — Изучение типичных культурально-морфологических свойств штамма E. coli К12: а – морфология и размеры клеток, б – рост в ГРМ бульоне, в – колонии По морфологии клетки указанного штамма представляли собой короткие грамотрицательные палочки с закругленными концами, размерами: 0,82 ± 0,15х2, ± 0,33 мкм, которые располагались одиночно (Рисунок 3 а). На рисунке 3б показан обильный диффузный рост E. coli О1 с небольшим, легко разбивающимся сероватым осадком. На ГРМ агаре (Рисунок 3 в) вырастали гладкие мутные S-колонии с ровными краями 3-4 мм в диаметре. На среде Эндо – выпуклые розовые колонии до 4 мм в диаметре (Рисунок 3 г). Клетки E. coli О1 ферментировали маннит, малонат, глюкозу с образованием газа и сохраняли подвижность (Таблица 1).

Род Pseudomonas. В следующей серии экспериментов были использованы бактерии P. aeruginosa spp., который является представителем условно-патогенной микрофлоры, встречающейся в почве, воде, на растениях, в желудочно-кишечном тракте человека и животных. Её широкое распространение во внешней среде способствует легкому инфицированию людей и животных. В госпитальных учреждениях распространены эковары синегнойной палочки, как правило, высокоустойчивые к антибиотикам и антисептикам (Маянский, 1999). В экспериментах использовали два штамма P. aeruginosa 27533 и P. aeruginosa 27853.

Согласно рисунку 4, а, клетки P. aeruginosa 27533 морфологически представляли собой типичные короткие подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами размерами 0,59 ± 0,02х2,11 ± 0,12 мкм. На ГРМ агаре бактерии P. aeruginosa 27533 образовывали плоские слизистые колонии 3-5 мм в диаметре с ровными краями и сине-зеленым пигментом (Рисунок 4 б). Культура издавала запах, напоминающий аромат жасмина. В ГРМ бульоне бактерии P. aeruginosa 27533 росли диффузно с образованием пленки на поверхности (Рисунок 4 в). Типичные биохимические свойства штамма P. aeruginosa 27533, подтвержденные нами в процессе данного предварительного этапа исследования, представлены в таблице 1.

Как и предполагалось, клетки этого штамма были подвижны, ферментировали Рисунок 3 - Изучение типичных культурально-морфологических свойств штамма E. coli О: а – морфология и размеры клеток, б – рост в ГРМ бульоне, в – колонии на Рисунок 4 - Изучение типичных культурально-морфологических свойств штамма P. aeruginosa 27533: а – морфология и размеры клеток, б – колонии на ГРМ агаре, глюкозу, лактозу, малонат, фенилаланин, лизин, образовывали сероводород и пигмент пиоцианин..

Дальнейшие исследования проводили с использованием бактерий штамма P. aeruginosa 27853. При посеве на твердые и жидкие питательные среды у микробных клеток P. aeruginosa 27853 была обнаружена типичная морфология для бактерий вида P. aeruginosa. Как видно на рисунке 5а, микроскопически они представляли собой грамотрицательные прямые палочки размерами 0,61 ± 0,03х1, ± 0,14 мкм; которые в бульоне давали равномерное помутнение (Рисунок 5 б). При культивировании на Difco Bacto-agar в аэробных условиях при температуре 37 оС (Рисунок 5 в) образовывали круглые слизистые колонии до 3 мм в диаметре с ровными краями и зеленым пигментом. Штамм P. aeruginosa 27853 оказался гемолитически активен (Рисунок 5 г). В соответствии с паспортом штамма P. aeruginosa 27853, клетки были подвижны, ферментировали глюкозу, лактозу, маннит, малонат, фенилаланин, желатину, лизин, образовывали сероводород и продуцировали пигмент пиоцианин (Таблица 1).

Таким образом, клетки каждого из выбранных нами штаммов E. coli B6, E. coli О1, E. coli к12 и P. aeruginosa 27533, P. aeruginosa 27853 обладали типичными микробиологическими свойствами, и могли быть использованы как модельные при проведении экспериментов по отработке условий инактивации бактерий методом ФДВ.

В ходе экспериментов инактивацию бактерий проводили методом ФДВ. Как известно, при ФДВ происходит повреждение биологических структур и нарушение их функций при поглощении света пигментом или красителем (акридины, антрахиноны, ряд порфиринов, рибофлавин, метиленовый синий и др.) в присутствии кислорода. Также известно, что к ФДВ чувствительны многие структуры на уровне организма, клетки и молекулы (Кару, 1985; Красновский (мл), 1990; Клебанов с соавт., 2001; Karu, 2003). Для повышения чувствительности Рисунок 5 - Изучение типичных культурально-морфологических свойств штамма P. aeruginosa 27853: а – морфология и размеры клеток, б – рост в бульоне, в – колонии на Difco агаре, г – колонии на кровяном агаре организмов (в частности микроорганизмов) к действию светового излучения применяют светочувствительные вещества фотосенсибилизаторы, к которым относят индоцианиновый зеленый, метиленовый синий, порфирины, аминолевулиновую кислоту, толуидин, тионин, фталоцианин и ряд других веществ (Большой энциклопедический словарь, 1999). При выборе фотосенсибилизатора и его базовых концентраций мы руководствовались результатами, которые изложены в работе Wilson et al. (1992), где показано действие лазерного излучения в комбинации с рядом экзогенных красителей на различные виды бактерий. В работе показано, что наиболее выраженное бактерицидное действие на все исследуемые бактерии оказывало лазерное излучение в комбинации с МС в концентрации 0,005%. Не менее важным мы посчитали тот факт, что в медицинской практике МС используют как антисептическое средство для наружного применения 1-3% спиртовой раствор, для промывания полостей и каналов – 0,02% водный раствор, для приема внутрь по 0,1 г 3-4 раза в день; при отравлениях окисью углерода, синильной кислотой, сероводородом назначают внутривенно 50-100 мл 1% водного раствора или 1% раствора в 25% растворе глюкозы; при отравлениях нитритами, анилином – внутривенно 0,1-0,15 мл 1% раствора на 1 кг массы тела (Машковский, 2005). В настоящее время МС используется в медицинской практике для проведения фотодинамической терапии (Брайцев., 1973; Посудин с соавт., 1982; Данилова с соавт., 1991; Кац с соавт., 1992; Коган с соавт., 1993; Странадко с соавт., 2001;





Dougherty, 1988; Walsh, 1997). Учитывая вышеизложенный материал, для исследований в качестве фотосенсибилизатора нами был выбран краситель МС в концентрациях 0,05 %; 0,005 % и 0,0005 %.

При выборе длины волны облучения учитывали данные, опубликованные Диксон М., Уэбб Э. в 1982 году (Диксон, 1982), а в дальнейшем проиллюстрированные Наумовым С.А. с соавт. (2012) где показано, что максимум спектра поглощения раствора МС находится в красной области спектра от 640 до 670 нм (Рисунок 6).

Таким образом, для модельных экспериментов по инактивации бактерий методом ФДВ нами были отобраны штаммы бактерий E. coli B6, E. coli K 12, E. coli O 1, P. aeruginosa 27533 и P. aeruginosa 27853 с типичными микробиологическими свойствами; фотосенсибилизатор метиленовый синий в концентрациях 0,05 %;

0,005 % и 0,0005 %; лазерные диоды с длиной волны излучаемого света = 650 нм, и световые диоды, с такой же длиной волны и шириной полосы излучения = 10 нм, лазер ( = 630 нм).

Рисунок 6 - Спектральные характеристики красителя метиленового синего 3.2. Разработка установки для инактивации бактерий методом Сначала в экспериментах по ФДВ на бактерии E. coli В6 был использован один диод, что не позволило проводить серию опытов за короткий промежуток времени.

Кроме того, нарушалась стандартность условий эксперимента. В связи с этим возникла объективная необходимость создания устройства, с помощью которого можно одновременно проводить опытные и контрольные исследования по инактивации бактерий методом ФДВ.

Для сбора установки использовали 96 луночные микропланшеты (МП). В МП № 1 вносили взвесь бактерий E. coli В6, предназначенную для инактивации, и раствор фотосенсибилизатора. МП № 2 представлял собой матрицу последовательно соединенных диодов, подключенную к источнику питания (Рисунок 7).

Рисунок 7 – Схема сконструированной установки для фотоинактивации бактерий E. coli В6 методом ФДВ: 1 – лунки микропланшета, содержащие взвесь бактерий E. coli В6 для облучения; 2 – лунки микропланшета с встроенными диодами; 3 – Нами были собраны два варианта установки: в одном варианте источниками излучения служили лазерные диоды (ЛД) с длиной волны излучаемого света = нм, во втором варианте – световые диоды (СД) с такой же длиной волны и шириной полосы излучения = 10 нм. В эксперименте варьировали мощность излучения (Р = 0,2; 0,6; 1 мВт) и соответственно плотность мощности излучения (I = 1, 3, мВт/см2). Для проведения инактивации методом ФДВ в лунки МП № 1 вносили по 0,2 мл взвеси бактерий E. coli В6 и раствора МС в необходимой концентрации. Затем его размещали над МП № 2. Таким образом, каждая лунка МП № 1 была снабжена индивидуальным источником излучения с регулируемым током питания.

Сконструированная нами лабораторная установка позволяла воздействовать на бактериальные взвеси светом с любыми заданными параметрами. Не менее важным, на наш взгляд, являлась возможность при необходимости проводить замену матрицы, которая могла содержать диоды с различной длиной волны света и регулируемой мощностью излучения. Большим преимуществом установки является также возможность получения за один сеанс ФДВ препаративного количества (38, мл) инактивированной бактериальной взвеси. Этого объема должно быть достаточно для проведения экспериментальных микробиологических, серологических и биологических исследований.

Другим преимуществом установки является сохранение стерильных условий во время проведения ФДВ. Для защиты облучаемых бактерий от контаминации посторонней микрофлорой МП № 1 накрывали стерильной крышкой. Если в процессе облучения одной и той же взвеси потребуется получить образцы с различным временем воздействия света, то для этого требовалось, приподняв крышку, только извлечь содержимое лунки при помощи дозатора. При этом остальные образцы непрерывно находились под воздействием света.

Не менее важным, на наш взгляд, является компактность установки. Данные качества позволили использовать ее в боксе биологической безопасности (Рисунок а) или в термостате с фиксированной температурой (Рисунок 8 б), в том случае если исследования требуют обеспечения режима облучения бактерий в процессе их роста.

Малые габариты установки особенно важны в тех случаях, когда эксперименты проводят с облигатными анаэробами и культивирование микроорганизмов проходит в анаэростате.

Рисунок 8 – Инактивация бактерий методом ФДВ в стерильных условиях бокса биологической безопасности (а); термостата (б) Преимуществом предложенной нами установки является также то, что в термостат или анаэростат можно поместить только занимающие малый объем планшеты с источником света и бактериальной взвесью, а все остальные составные части установки могут располагаться вне камеры.

3.3. Влияние различных концентраций метиленового синего на колониеобразующую способность бактерий E. coli spp. и P. aeruginosa spp.

Оптимальных параметров ФДВ на бактерии in vitro, при которых все клетки теряли бы колониеобразующую способность, в литературе нами не найдено.

Поэтому в модельных экспериментах была предварительно проведена оценка зависимости количества КОЕ бактерий E. coli В6, E. coli К12, E. coli О1, P. aeruginosa 27533 и P. aeruginosa 27853 от: концентрации МС и, времени экспозиции взвесей указанных бактерий с МС.



Pages:     | 1 |   ...   | 11 | 12 || 14 | 15 |   ...   | 31 |
 


Похожие материалы:

« СТЕПАНОВ Николай Витальевич СОСУДИСТЫЕ РАСТЕНИЯ ПРИЕНИСЕЙСКИХ САЯН 03.02.14 - Биологические ресурсы Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук Красноярск 2014 СОДЕРЖАНИЕ 4 Введение Глава 1. История исследования флоры 14 Глава 2. Физико-географические условия. 28 29 2.1. Геоморфология, орогенез, геология 33 2.2. Гидрография 35 2.3. Климат 39 2.4. Почвы 41 2.5. Растительность Глава 3. Материалы и методы исследований. 72 Глава 4. Анализ флоры сосудистых ...»

«НА ПРАВАХ РУКОПИСИ СИГИДА РОМАН СЕРГЕЕВИЧ ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ РИТМОСТАЗА У ПОДРОСТКОВ С РАЗЛИЧНОЙ АДАПТАЦИЕЙ К УЧЕБНЫМ НАГРУЗКАМ 03.00.13 – ФИЗИОЛОГИЯ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.А. Батурин Ставрополь - 2004 2 Принятые сокращения АД –артериальное давление АМо- амплитуда моды АП - адаптационный потенциал ВПМ- вариационная пульсометрия ДАД –диастолическое артериальное давление ДМ –динамометрия ...»

« РЫЛЬНИКОВ Валентин Андреевич ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И ПОДХОДЫ К УПРАВЛЕНИЮ ЧИСЛЕННОСТЬЮ СИНАНТРОПНЫХ ВИДОВ ГРЫЗУНОВ (на примере серой крысы Rattus norvegicus Berk.) Специальность 03.00.16 – экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Пермь – 2007 2 Оглавление Введение………………………………………………………………………. 7 Глава 1. Обзор литературы 1.1. Экология серой крысы (пасюк)………………………………………… 25 1.1.1. Характеристика питания серой крысы…….………………………… 25 1.1.2. ...»

« Подсвирова Ирина Александровна Микробиологический мониторинг патогенов гнойновоспалительных заболеваний в хирургических отделениях и в отделении реанимации и интенсивной терапии в многопрофильном стационаре 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Андрей Юрьевич Миронов доктор медицинских наук Елена Васильевна Алиева Ставрополь — 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ...»

« Орлова Дарья Юрьевна КИНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ И ЛАЗЕРНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОСКОПИИ Специальность 03.01.02 – биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук. Научный руководитель доктор физико-математических наук Мальцев В.П. Новосибирск – 2011 Содержание Введение Глава 1 Обзор литературы 1.1. “Лиганд” и “рецептор”. Типы клеточных рецепторов ...»

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»








 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.