Ульянова онега владимировна методология повышения безопасности бактериальных вакцин на модели вакцинных штаммов brucella abortus 19 ba, francisella tularensis 15 нииэг, yersinia

В первой серии экспериментов определяли колониеобразующую способность бактерий E. coli В6, E. coli К12, E. coli О1 и P. aeruginosa 27533 при экспозиции с МС. Для этого готовили бактериальные взвеси в концентрации 1·10 9 м.к./мл. МС использовали в концентрациях 0,0005; 0,005; 0,05 %. Время экспозиции каждой бактериальной взвеси с МС варьировали от 5 до 20 мин. В опытные лунки МП № вносили по 0,2 мл одной из взвеси 2-х суточных агаровых культур и по 0,2 мл МС в концентрациях 0,0005; 0,005; 0,05 %. В контрольные лунки вместо МС добавляли 0, мл физиологического раствора. После экспозиции в течение 5, 10, 15 или 20 мин взвеси из лунок разводили физиологическим раствором до содержания бактерий 1·103 м.к./мл и высевали в объеме 100 мкл на плотные питательные среды. После инкубации посевов в течение 48 ч при температуре 37 оС подсчитывали число КОЕ.

Число выросших колоний выражали в процентах, количество КОЕ в контрольных чашках принимали за 100 %.

На рисунке 9 представлено количество КОЕ бактерий E. coli В6, E. coli К12, E. coli О1 и P. aeruginosa 27533 после экспозиции с МС различной концентрации.

Как видно из представленных результатов концентрации МС 0,0005 % и 0,005 % не оказывали значимого бактерицидного действия на клетки бактерий E. coli spp. и P. aeruginosa 27533 (Рисунок 9 а, б). МС в концентрации 0,05 % также незначительно подавлял рост бактерий E. coli spp. после экспозиции в течение 5 мин.

При контакте бактерий с МС в течение 10, 15 и 20 мин число КОЕ снижалось, по сравнению с контрольными значениями (100 %): штамма E. coli В6 (49 ± 6 % – мин), штамма E. coli К12 (51 ± 4 % – 10 мин), штамма E. coli О1 (47 ± 5 % – 15 мин).

Бактерии P. aeruginosa 27533 были более устойчивы к действию МС, так максимальное достоверное снижение числа КОЕ отмечалось лишь до 79 ± 5 % через 10 мин экспозиции с МС (Рисунок 9 в).

Так как МС в испытуемых концентрациях (0,0005; 0,005; 0,05 %) не вызывали выраженного угнетения роста бактерий E. coli spp. и P. aeruginosa spp., было принято решение использовать их в экспериментах по инактивации бактерий методом ФДВ.

Рисунок 9 - Изменение числа КОЕ бактерий E. coli В6, E. coli К12, E. coli О1 и P. aeruginosa 27533 после экспозиции с МС в концентрациях 0,0005 % (а); 0,005 % (б); 0,05 % (в), в течение 5-20 мин: Кк - контроль культуры 3.4. Влияние на колониеобразующую способность бактерий E. coli spp. и P. aeruginosa spp. красного излучения разных источников Во второй серии экспериментов определяли количество КОЕ бактерий E. сoli В6, E. сoli К12, E. сoli О1 и P. aeruginosa 27533 после воздействия красного излучения.

Использовали, как и в первой серии опытов, 2-х суточные агаровые культуры указанных штаммов бактерий в концентрации 1·109 м.к./мл. В эксперименте сравнивали действие лазерных и световых диодов, используя матрицы с лазерными диодами – ЛД (= 650 нм) или световыми диодами – СД (= 650 ± 10 нм). Облучение проводили на созданной нами установке в течение 5, 10, 15 или 20 мин. Меняли плотность мощности излучения I=1; 3 или 5 мВт/см2. Для постановки контроля использовали необлученные взвеси бактерий.

В лунки МП № 1 вносили по 0,2 мл исследуемой бактериальной взвеси и добавляли по 0,2 мл физиологического раствора (вместо 0,2 мл МС для сохранения объема облучаемой взвеси). После облучения взвесь из лунки разводили до содержания 1·103 м.к./мл, затем 100 мкл этой взвеси высевали на плотную питательную среду и инкубировали при температуре 37 оС. Через 48 ч учитывали рост КОЕ. Анализ действия ЛД и СД излучений представлен на рисунке 10. Число КОЕ бактерий E. сoli В6, E. сoli К12, E. сoli О1 и P. aeruginosa 27533 находилось в пределах контрольных значений после воздействия ЛД или СД (I = 1 мВт/см2) в течение 5, 10, 15 или 20 мин (Рисунок 10 а). Стимуляцию роста клеток E. сoli В вызвало облучение ЛД (I = 3 мВт/см2) в течение 10 и 15 мин; число КОЕ увеличивалось до 110 ± 5 и 112 ± 5 % соответственно. После воздействия излучения ЛД в течение 20 мин отмечалось незначительное повышение числа КОЕ P. aeruginosa 27533 – 109 ± 5 % (I = 3 мВт/см2) (Рисунок 10 б); 106 ± 3 % (I = мВт/см2) (Рисунок 10 в). Как видно на рисунке 10, в, достоверно значимое снижение количества КОЕ зарегистрировано при облучении ЛД (I=5 мВт/см2) в течение мин: E. сoli В6 – 78±5 %; E. сoli К12 – 75 ± 4 %; E. сoli О1 86 ± 3 %. Подавляло Рисунок 10 - Изменение числа КОЕ бактерий E. coli В6, E. coli К12, E. coli О и P. aeruginosa 27533 после облучения лазерными (ЛД) или световыми диодами (СД) с заданной плотностью мощности: I=1 мВт/см (а); I =3 мВт/см (б); I=5мВт/см (в):

размножение бактерий и СД облучение (I = 5 мВт/см2), вызывая снижение числа КОЕ бактерий: E. сoli В6 (72 ± 4 % – 15 и 20 мин); E. сoli К12 (84 ± 4 % – 10 мин, ± 3 % - 15 мин, 75 ± 3 % – 20 мин); E. сoli О1 (76 ± 6 % – 15 мин, 84 ± 4 % – 20 мин) (Рисунок 10 в).

В результате изучения изменения числа КОЕ бактерий E. coli spp. и P. aeruginosa 27533 при облучении ЛД и СД выявлено, что как стимуляция так и подавление роста исследуемых бактерий, зависят от изменения плотности мощности красного фотодиодного излучения и времени облучения бактерий. Полного отсутствия роста исследуемых бактерий не наблюдалось и закономерности воздействия фотодиодного излучения на размножение бактерий не выявлено.

В связи с тем, что воздействие как световыми так и лазерными диодами не P. aeruginosa 27533, то для дальнейших исследований инактивации этих штаммов методом ФДВ использовали в лабораторной установке оба вида фотодиодов.

3.5. Влияние на колониеобразующую способность бактерий E. coli spp. и P. aeruginosa spp. фотодинамического воздействия Далее были проведены исследования по оценке колониеобразующей способности бактерий E. сoli В6, E. сoli К12, E. сoli О1 и P. aeruginosa 27533 после инактивации методом ФДВ в двух вариантах на сконструированной нами установке: с использованием лазерных или световых диодов. В экспериментах меняли плотность мощности облучения (I = 1; 3 или 5 мВт/см2), концентрацию метиленового синего (МС = 0,05; 0,005; 0,0005 %) и время облучения (от 5 до20 мин). Параллельно с опытом проводили три контрольных исследования: в первом - контроль количества КОЕ бактериальной взвеси; во втором - число КОЕ бактериальной взвеси после экспозиции только с МС; в третьем – учитывали количество КОЕ культур клеток после облучения ЛД или СД, исключая действие фотосенсиблизатора. Результаты проведенных экспериментов представлены на рисунках 11-14.

Достоверное снижение числа КОЕ E. coli B6 отмечали после ФДВ (I = 1 мВт/см2;

МС = 0,0005 %) через 5 мин до 81 ± 4 % (ЛД) и 86 ± 5 % (СД) (Рисунок 11 а); через 20 мин - до 44 ± 4 % (ЛД) и 31 ± 5 % (СД) (Рисунок 11 б). При увеличении плотности мощности излучения до I = 3 мВт/см2 и концентрации МС = 0,05 %, наименьшее количество КОЕ E. coli B6 было зарегистрировано после ФДВ через 15 мин – 50 ± 5 % (ЛД) и 52 ± 5 % с (СД) (Рисунок 11 в). Дальнейшее увеличение I = 5 мВт/см привело к угнетению роста бактерий E. coli B6 после ФДВ в присутствии МС =0,005 % при облучении ЛД в течение 15 мин – 36 ± 3 %; и СД в течение 20 мин – 55 ± 8 % (Рисунок 11 б).

Анализ колониеобразующей способности бактерий штамма E. coli К12 после ФДВ показал, что на количество КОЕ оказывают влияние как СД, так и ЛД.

Снижение числа КОЕ происходило после облучения ЛД (I = 3 мВт/см2; МС = 0,05 %) в течение 15 мин – 42 ± 2 % (Рисунок 12 в). Выраженное угнетение роста бактерий E. coli К12 до КОЕ = 38 ± 4 % отмечали после 20 мин ФДВ (I = 1 мВт/см2; МС = 0,005 %) при использовании в установке СД (Рисунок 12 б). В остальных случаях ФДВ клетки штамма E. coli К12 были более устойчивы к ФДВ.

Выявлено подавление роста бактерий штамма E. coli О1, КОЕ = 35 ± 4 %, вызванное облучением ЛД (I = 5 мВт/см2; МС = 0,05 %) в течение 15 мин (Рисунок 13 в). Более чем на 40 % снижался рост изучаемых бактерий при облучении СД (I = мВт/см2; МС = 0,005 %) в течение 20 мин – КОЕ = 38 ± 1; и в течение 15 мин (I = мВт/см2; МС = 0,05 %) – КОЕ = 29 ± 5 % (Рисунок 13 б, в). Было отмечено также снижение числа КОЕ E. coli О1 через 20 мин после воздействия СД (37 ± 1 %) или ЛД (49 ± 3 %) плотностью мощности 1 мВт/см2 в присутствии МС = 0,05 %.

Рост бактерий штамма P. aeruginosa 27533 наиболее эффектив,но снижался через 15 мин ФДВ (I = 1 мВт/см2; МС = 0,005 %) при использовании в установке как ЛД (КОЕ = 38 ± 4 %), так и СД (44 ± 4 %) (Рисунок 14 б).

Рисунок 11 – Изменение числа КОЕ бактерий E. coli В6 после ФДВ с использованием лазерных диодов (Олд) или световых диодов (Осд) с заданной концентрацией МС: 0,0005 % (а); 0,005 % (б); 0,05 % (в): Кк – контроль культуры;

Кмс – контроль культуры с МС; Клд – контроль облучения лазерными диодами;

Рисунок 12 – Изменение числа КОЕ бактерий E. coli К12 после ФДВ с использованием лазерных диодов (Олд) или световых диодов (Осд) с заданной концентрацией МС: 0,0005 % (а); 0,005 % (б); 0,05 % (в): Кк – контроль культуры; Кмс – контроль культуры с МС; Клд – контроль облучения лазерными диодами;

Рисунок 13 – Изменение числа КОЕ бактерий E. coli O1 после ФДВ с использованием лазерных диодов (Олд) или световых диодов (Осд) с заданной концентрацией МС: 0,0005 % (а); 0,005 % (б); 0,05 % (в): Кк – контроль культуры; Кмс – контроль культуры с МС; Клд – контроль облучения лазерными диодами;

Рисунок 14 – Изменение числа КОЕ бактерий P. aeruginosa 27533 после ФДВ с использованием лазерных диодов (Олд) или световых диодов (Осд) с заданной концентрацией МС: 0,0005 % (а); 0,005 % (б); 0,05 % (в): Кк – контроль культуры; Кмс – контроль культуры с МС; Клд – контроль облучения лазерными диодами;

В следующей серии экспериментов была изучена колониеобразующая способность бактерий штамма P. aeruginosa 27853 после ФДВ с использованием красного лазера ( = 630 нм, Р = 40 мВт, I = 200 мВт/см2) и метиленового синего в двух концентрациях (0,5 и 5 %), инактивацию проводили в течение 10, 15 и 20 мин.

В таблицах 2 и 3 представлены результаты опытов в сравнении с контрольными значениями числа КОЕ интактной культуры, на которую воздействовали только лазерным излучением или только МС.

Таблица 2 – Изменение числа КОЕ бактерий P. aeruginosa 27853 после ФДВ мин Таблица 3 – Изменение числа КОЕ бактерий P. aeruginosa 27853 после ФДВ мин Показано, что минимальное количество КОЕ = 2 ± 0,1 % было при ФДВ на клетки P. aeruginosa 27853 в течение 15 мин с использованием МС в концентрации 0,5 % (Таблица 2). При повышении концентрации фотосенсибилизатора до 5 % число КОЕ, указанных бактерий, снижалось лишь до 29 ± 2 % (Таблица 3).

В результате проведенных экспериментальных исследований по инактивации бактерий E. сoli В6, E. сoli К12, E. сoli О1, P. aeruginosa 27533 и P. aeruginosa выявлено, что на снижение/увеличение числа КОЕ влияют изменения: источников облучения (лазер, лазерные или световые диоды); концентрации фотосенсибилизатора (МС = 0,0005; 0,005; 0,05; 0,5; 5 %); плотности мощности изучения (1, 3, 5, 200 мВт/см2), а также времени облучения (5, 10, 15, 20 мин). В ходе исследований полной инактивации культур не зарегистрировано и не выявлено закономерностей снижения/повышения числа КОЕ, в зависимости от параметров ФДВ.

Как показали проведенные исследования, на колониеобразующую способность бактерий E. coli spp. и P. aeruginosa spp. при проведении инактивации влияют различные параметры ФДВ, которые подобрать эмпирическим путем чрезвычайно сложно и для этого потребуется весьма продолжительное время. Поэтому, нами было принято решение провести анализ взаимодействия бактериальных клеток и лазерного излучения, построить математическую модель их взаимодействия для определения оптимальных параметров ФДВ, при которых будет происходить 100 % инактивация бактерий.

3.6. Оптимизация условий инактивации бактерий E. сoli spp. и P. aeruginosa spp.