WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS


Pages:     | 1 |   ...   | 15 | 16 || 18 | 19 |   ...   | 31 |

Ульянова онега владимировна методология повышения безопасности бактериальных вакцин на модели вакцинных штаммов brucella abortus 19 ba, francisella tularensis 15 нииэг, yersinia

-- [ Страница 17 ] --

3.7. Колониеобразующая способность и культурально-морфологические свойства бактерий E. coli spp. и P. aeruginosa spp. после проведения инактивации методом фотодинамического воздействия Инактивацию бактерий E. coli spp. и P. aeruginosa 27533 проводили на сконструированной установке методом ФДВ в течение 5-360 мин при следующих условиях: концентрация клеток в бактериальной взвеси 1·109 м.к./мл, концентрация раствора МС = 0,005 %; плотность мощности излучение I = 1 мВт/см2. На бактерии P. aeruginosa 27853 воздействовали лазером (I = 200 мВт/см2), концентрация МС = 0,5 или 5 %, время инактивации 10-180 мин. После инактивации взвеси бактерий E. coli В6, E. coli К12, E. coli О1, и P. aeruginosa 27533 высевали на плотные питательные среды, инкубировали в термостате при температуре 37 oС в течение сут, ежедневно просматривая чашки и, фиксируя число КОЕ.

Результаты изменения количества КОЕ бактерий E. coli В6, E. coli К12, E. coli О после ФДВ (0,005 % МС, I = 1 мВт/см2) представлены на рисунках 29 - 32.

После 5 мин ФДВ число КОЕ снижалось у представленных штаммов по сравнению с контрольными величинами: E. coli В6 (Осд – 89±5 %; Кмс – 97±5 %;

Ксд – 98±4 %), E. coli К12 (Осд – 85±5 %; Кмс – 96±5 %; Ксд – 103±3 %), E. coli О (Осд – 85±2 %; Кмс – 98±5 %; Ксд – 97±3 %). На 15 мин отмечали незначительную активацию роста бактерий по сравнению с 10 мин воздействия, но она меньше контрольных значений.

Начиная с 20 мин ФДВ, количество КОЕ снижалось, и после 60 мин воздействия рост бактерий на агаре и в бульоне полностью отсутствовал.

Морфологических изменений бактерий E. сoli В6 и E. сoli К12 не наблюдалось.

Изменений тинкториальных свойств не было. Средние размеры клеток не отличались от необлученной культуры и составляли для E. сoli В6 – 0,61х2,68 мкм, для E. сoli К12– 0,42х2,10 мкм (Таблица 5).

Рисунок 29 – Изменение числа КОЕ бактерий E. coli В6 после ФДВ Рисунок 30 – Изменение числа КОЕ бактерий E. coli К 12 после ФДВ Рисунок 31 – Изменение числа КОЕ бактерий E. coli О1 после ФДВ Рисунок 32 – Изменение числа КОЕ бактерий E. coli B6 (а), E. coli K12 (б), E. coli O (в) после ФДВ (I=1мВт/см2 ; 0,005% МС); О – опыт, ФДВ; контроли: Кк –культуры;

Проведение микроскопии препаратов бактерий штамма E. сoli О1 показало изменение морфологии клеток после ФДВ: они приобрели более вытянутую форму по сравнению с необлученной культурой 0,38 х 1,58 мкм (Таблица 5).

Таблица 5 – Размеры E. сoli разных штаммов клеток до и после ФДВ, мкм Колониеобразующая способность бактерий штамма P. aeruginosa 27533, представлена на рисунках 33 и 36. Инактивацию бактерий проводили в течение 5 – 360 мин на созданной установке, используя МС в концентрации 0,005 %, меняя плотность мощности излучения: 1; 3; и 5 мВт/см2. Несмотря на то, что гарантированная инактивация бактерий должна быть после 40 мин облучения (согласно проведенному компьютерному моделированию), в эксперименте in vitro мы наблюдали лишь снижение численности бактерий по сравнению с контрольными значениями. Рост бактерий снижался до 40 % через 15, 60, 120 и 180 мин ФДВ (I = мВт/см2; МС = 0,05 %). После 6 ч ФДВ на взвесь бактерий P. aeruginosa отмечали стимуляцию роста клеток, число КОЕ увеличилось до 79±4 % (Рисунок 36).

Рисунок 33 – Изменение числа КОЕ бактерий P. aeruginosa 27533 после ФДВ Рисунок 34 – Изменение числа КОЕ бактерий P. aeruginosa 27533 после ФДВ Рисунок 35 – Изменение числа КОЕ бактерий P. aeruginosa 27533 после ФДВ Рисунок 36 – Изменение числа КОЕ бактерий P. aeruginosa 27533 после ФДВ:

МС=0,005%; I=1мВт/см2 (а), I=3мВт/см2 (б), I=5мВт/см2 (в) Клетки штамма P. aeruginosa 27853 инактивировали красным лазером ( = нм, I = 200 мВт/см2). К взвеси клеток добавляли раствор МС в концентрациях 0,5 и 5 %. Результаты показаны на рисунках 37 – 39. На клетки воздействовали от 10 мин до 3 ч. Интересно отметить, что наиболее выраженный бактерицидный эффект наблюдали в опытах с меньшей концентрацией МС (0,5 %), количество КОЕ снижалось до 2 ± 0,1 % (Кмс = 64±3 %; Кл = 60 ± 2 %) после 15 мин ФДВ.

Максимальный рост числа клеток – КОЕ = 13 ± 4 % (Кмс = 52 ± 1 %; Кл = 51 ± 4 %) – регистрировали через 30 мин ФДВ ( = 630 нм, I = 200 мВт/см2; МС = 0,5 %).

При инактивации бактерий штамма P. aeruginosa 27853 в условиях ФДВ ( = нм, I = 200 мВт/см2; МС = 5 %) минимальное количество КОЕ = 23 ± 2 % (Кмс = 57 ± 5 %; Кл = 52 ± 2 %) отмечали через 30 мин ФДВ, а максимальное – КОЕ = 67 ± 4 % (Кмс = 31±3 %; Кл = 34±2 %) через 40 мин. Дальнейшее ФДВ в течение 40 - 180 мин на клетки указанного штамма бактерий приводило к снижению числа КОЕ, однако не приводило к полной инактивации бактерий штамма P. aeruginosa 27853.

Бактерии штаммов P. aeruginosa 27533 и P. aeruginosa 27853 не утратили колониеобразующую способность под длительным фотодинамическим воздействием красного светодиодного (I = 1 мВт/см2) и лазерного (I = 200 мВт/см2) излучения. Скорее всего, это связано с облигатной аэробностью, мощной антиоксидантной защитой и наличием монооксидаз (окислительных ферментов), что является общей особенностью всех псевдомонад (Маянский, 1999).

Микроскопический анализ клеток P. aeruginosa 27533 и 27853, прошедших ФДВ не выявил изменений тинкториальных и морфологических свойств клеток (Таблица 6).

Бактерии P. aeruginosa 27853 при культивировании на плотных и жидких питательных средах при температуре 37 oС давали характерный рост. При облучении клеток P. aeruginosa 27853 с добавлением к взвеси 0,5 % МС прекращалась продукция пиоцианина (Рисунок 40). Изменения биохимической активности у бактерий упомянутого штамма после инактивации представлены в таблице 7.





Рисунок 37 – Изменение числа КОЕ бактерий P. aeruginosa 27853 после ФДВ Рисунок 38 – Изменение числа КОЕ бактерий P. aeruginosa 27853 после ФДВ Рисунок 39 - Изменение числа КОЕ бактерий P. aeruginosa 27853 после ФДВ:

Таблица 6 – Размеры клеток P. aeruginosa spp. до и после ФДВ, мкм Штамм бактерий P. aeruginosa P. aeruginosa При посеве взвеси P. aeruginosa 27853 после ФДВ на 5 % кровяной агар было отмечено отсутствие гемолитической активности в случае облучения лазером (I = 200 мВт/см2) с 5 %-ным раствором МС в течение 20 мин (Рисунок 41).

Гемолитическая активность является важным фактором патогенности псевдомонад (Коротяев, 2002). Поскольку гемолитическая активность клеток штамма P. aeruginosa 27853 была утрачена под действием ФДВ, решено было проверить патогенные свойства этих бактерий на белых крысах. Взвесью культуры P. aeruginosa 27853, утратившей гемолитическую активность после ФДВ, провели накожное заражение 10-ти белых крыс. Другую группу из 10-ти крыс заразили аналогичным способом интактной культурой (контроль). Наблюдали за животными в течение 14 суток. В контрольной группе на 4-5 сутки после заражения отмечалась пиодермия, на поверхности скарифицированной кожи был сине-зеленый гной.

Зарегистрировано повышение температуры тела до 41 ± 1 оС, снижение аппетита.

В опытной группе животных пиодермии не наблюдали, температура тела сохранялась нормальная, отклонений в поведении животных не отмечали.

Таким образом, на первом этапе исследований были выбраны штаммы грамотрицательных бактерий E. coli В6, E. coli К12, E. coli О1, P. aeruginosa 27533, P. aeruginosa 27853 для проведения модельных экспериментов по инактивации бактерий методом ФДВ. Обоснованно выбран фотосенсибилизатор метиленовый Таблица 7 – Биохимические свойства бактерий P. aeruginosa spp.до и после после ФДВ P. aeruginosa до ФДВ P. aeruginosa после после ФДВ P. aeruginosa до ФДВ P. aeruginosa после после ФДВ Рисунок 40 – Рост клеток P. aeruginosa 27853 после ФДВ (МС = 0,5 %; I = 200 мВт/см2;), отсутствие пигмента пиоцианина Рисунок 41 – Рост культуры P. aeruginosa 27853 на 5 % кровяном агаре: интактные бактерии, гемолиз (а); бактерии после ФДВ (I = 200 мВт/см2, МС = 5%) в течение мин, отсутствие гемолитической активности (б) синий и его концентрация 0,005 %. Определена длина волны облучения (650 ± 10 нм) и источник излучения (световые диоды).

Разработана и создана лабораторная установка для проведения фотоинактивации бактерий E. coli В6, E. coli К12, E. coli О1 и P. aeruginosa 27533, которая имеет ряд несомненных преимуществ перед уже имеющимися:

во-первых, ФДВ на бактериальные клетки проходило в стерильных условиях, что позволило использовать инактивированные бактерии для дальнейших исследований (микробиологических, серологических и биологических);

во-вторых, используя установку можно варьировать концентрацию бактериальных клеток, фотосенсибилизатора, параметры облучения, такие как длительность, доза, плотность мощности излучения;

в-третьих, за один сеанс облучения удается получить препаративное количество (38,4 мл) бактериальной взвеси;

в-четвертых, благодаря компактным размерам установки ФДВ можно проводить в ламинарном боксе, анаэростате или термостате с фиксированной температурой.

В результате компьютерного моделирования определена область эффективного воздействия синглетного кислорода на клеточную мембрану бактерий, которая равна диаметру клетки; создана математическая модель взаимодействия бактериальных клеток и излучения, проведена идентификация параметров ФДВ на бактерии E. coli spp. и P. aeruginosa spp.; на основе математического моделирования и компьютерного эксперимента найдены коэффициенты, определяющие нелинейную модель взаимодействия света с клетками, и показана вероятность инактивации всех клеток взвеси при длительности облучения более 40 мин.

В эксперименте in vitro получены полностью инактивированные клетки штаммов E. coli spp. методом ФДВ при облучении световыми диодами (I = 1 мВт/см2) в фотосенсибилизатора МС в концентрации 0,005 %.

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ

BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ И

YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ ПОСЛЕ ИНАКТИВАЦИИ МЕТОДОМ

ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

На предыдущем этапе диссертационных исследований нам удалось получить полностью инактивированные бактерии модельных штаммов E. coli spp. методом ФДВ на созданной установке. Полученные результаты предопределили возможность проведения на нашей установке инактивации бактерий вакцинных штаммов B. abortus 19 BA, F. tularensis 15 и Y. pestis EV для повышения их безопасности. В экспериментах для инактивации бактерий методом ФДВ использовали созданную установку, в состав которой входили красные светодиоды (0 = 650 ± 10 нм), плотность мощности излучения составляла I = 1, 3 и 5 мВт/см2. В качестве фотосенсибилизатора использовали растворы МС в концентрациях 0,0005; 0,005;

0,05 %. Время взаимодействия меняли от 5 до 360 мин. Наряду с опытными исследованиями проводили контрольные, учитывая воздействие на бактерии только фотосенсибилизатора или светодиодного излучения.

4.1. Характеристика культурально-морфологических, биохимических и серологических свойств бактерий вакцинного штамма B. abortus 19 BA Для выполнения настоящего раздела диссертационной работы использовали бактерии вакцинного штамма B. abortus 19 ВА. На первом этапе исследований проверяли культурально-морфологические, биохимические и тинкториальные свойства для подтверждения типичных свойств выбранного штамма бактерий.



Pages:     | 1 |   ...   | 15 | 16 || 18 | 19 |   ...   | 31 |
 


Похожие материалы:

« СТЕПАНОВ Николай Витальевич СОСУДИСТЫЕ РАСТЕНИЯ ПРИЕНИСЕЙСКИХ САЯН 03.02.14 - Биологические ресурсы Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук Красноярск 2014 СОДЕРЖАНИЕ 4 Введение Глава 1. История исследования флоры 14 Глава 2. Физико-географические условия. 28 29 2.1. Геоморфология, орогенез, геология 33 2.2. Гидрография 35 2.3. Климат 39 2.4. Почвы 41 2.5. Растительность Глава 3. Материалы и методы исследований. 72 Глава 4. Анализ флоры сосудистых ...»

«НА ПРАВАХ РУКОПИСИ СИГИДА РОМАН СЕРГЕЕВИЧ ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ РИТМОСТАЗА У ПОДРОСТКОВ С РАЗЛИЧНОЙ АДАПТАЦИЕЙ К УЧЕБНЫМ НАГРУЗКАМ 03.00.13 – ФИЗИОЛОГИЯ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.А. Батурин Ставрополь - 2004 2 Принятые сокращения АД –артериальное давление АМо- амплитуда моды АП - адаптационный потенциал ВПМ- вариационная пульсометрия ДАД –диастолическое артериальное давление ДМ –динамометрия ...»

« РЫЛЬНИКОВ Валентин Андреевич ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И ПОДХОДЫ К УПРАВЛЕНИЮ ЧИСЛЕННОСТЬЮ СИНАНТРОПНЫХ ВИДОВ ГРЫЗУНОВ (на примере серой крысы Rattus norvegicus Berk.) Специальность 03.00.16 – экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Пермь – 2007 2 Оглавление Введение………………………………………………………………………. 7 Глава 1. Обзор литературы 1.1. Экология серой крысы (пасюк)………………………………………… 25 1.1.1. Характеристика питания серой крысы…….………………………… 25 1.1.2. ...»

« Подсвирова Ирина Александровна Микробиологический мониторинг патогенов гнойновоспалительных заболеваний в хирургических отделениях и в отделении реанимации и интенсивной терапии в многопрофильном стационаре 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Андрей Юрьевич Миронов доктор медицинских наук Елена Васильевна Алиева Ставрополь — 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ...»

« Орлова Дарья Юрьевна КИНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ И ЛАЗЕРНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОСКОПИИ Специальность 03.01.02 – биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук. Научный руководитель доктор физико-математических наук Мальцев В.П. Новосибирск – 2011 Содержание Введение Глава 1 Обзор литературы 1.1. “Лиганд” и “рецептор”. Типы клеточных рецепторов ...»

« 'Oi.200.7 1 5 5 9 3 МИНАЕВА Любовь Валерьевна ^/-/eMaci^cL^ ЭКСПЕРРТМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦРЖЛОФОСФАНА 14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.И.Карпищенко кандидат медицинских наук С.И.Глушков САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2007 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ...»

« ЛАРИОНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ РАЗНООБРАЗИЕ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ГРАДИЕНТЕ КОНТИНЕНТАЛЬНОСТИ КЛИМАТА В ХАКАСИИ 03.00.05 – БОТАНИКА Научный руководитель Ермаков Николай Борисович д.б.н., с.н.с. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цели и задачи исследования Защищаемые положения Научная новизна Практическая значимость Апробация работы и публикации Благодарности ГЛАВА 1. ...»

«Кочерина Наталья Викторовна АЛГОРИТМЫ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Специальность 03.00.15 – Генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН В. А. Драгавцев Санкт–Петербург – 2009 2 Оглавление Глава I. Введение…………………………………………………….……….…4 О реальной природе организации сложных полигенных экономически важных признаков растений…….……………………9 Глава II. Постановка задач ...»

« ГАЛКИНА МАРИЯ АНДРЕЕВНА БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИОННЫХ ВИДОВ РОДА BIDENS L. В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.01 – БОТАНИКА ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный руководитель д.б.н. Виноградова Ю.К. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ……………………………………………………………………….4 Глава 1. Объекты и методы ………………………………………………….10 Глава 2. История распространения инвазионных видов рода Bidens L. на территории Европы …………………………………… Глава 3. ...»

« Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 17 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36 ГЛАВА 4. МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО ...»








 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.