Ульянова онега владимировна методология повышения безопасности бактериальных вакцин на модели вакцинных штаммов brucella abortus 19 ba, francisella tularensis 15 нииэг, yersinia

Наиболее эффективным подавление роста бактерий было при ФДВ в течение мин при I = 5мВт/см2, число КОЕ было снижено до 7 ± 0,1 %, по сравнению с контрольными значениями. Тем не менее, полной инактивации бактерий F. tularensis 15 зарегистрировано не было.

Используя математическую модель первого типа, которую построили для случая инактивации бактерий штамма P. aeruginosa 27853, не удалось провести идентификацию параметров взаимодействия клеток вакцинного штамма туляремии и светодиодного излучения. Необходимо было провести построение математической модели иного типа. Предполагалось, что попадание молекулы О2* в клеточную мембрану инициирует ее первичные изменения, которые описываются величиной m*, характеризующей степень поражения клетки-мишени (в данном случае клетки F. tularensis M m m (M = 1, при отсутствии изменений в клетке, M = 0 в случае полной утраты жизнеспособности клетки). В клетке, в процессе облучения, должны запускаться также восстановительные процессы, обусловленные действием АО системы. Эти процессы, как правило, компенсируют изменения, вызванные восстановительные способности клетки тем больше, чем меньше изменения в клеточной мембране в результате ПОЛ, инициированных действием свободного радикала О2*. Тогда, восстановительные процессы в клетке описываются соотношением:

где - скорость восстановления клетки; 0.

Как известно, величина структурных изменений клетки пропорциональна количеству молекул О2*, попадающих в клеточную мембрану и тем больше, чем меньше степень ее поражения M. В свою очередь, количество образующихся молекул О2* пропорционально концентрации (С) МС и интенсивности света I(t), облучающего раствор. Таким образом, где (положительная константа) – скорость поражения клетки за счет фотодинамического воздействия; P(t ) S I (t ) – мгновенная мощность излучения, равная произведению мгновенной интенсивности на площадь облучаемой взвеси.

Окончательное уравнение, описывающее динамические изменения в бактериальной клетке, имеет следующий вид:

P(t) является случайной величиной, которая для случая динамических лазерных спеклов подчиняется экспоненциальному статистическому распределению. Контраст спеклов равен 0.7, если для облучения используются деполяризованные спекл-поля, продуцируемые низкокогерентными источниками света (в настоящей работе – световыми диодами).

Была проведена идентификация параметров модели на основе данных экспериментальных исследований. В идеальном случае облучения бактериальной взвеси светом с постоянной интенсивностью решение последнего уравнения имеет следующий вид:

С учетом того, что отклик клетки на мгновенное изменение интенсивности может быть существенно нелинейным, решение целесообразно искать в виде (модель второго типа):

С использованием предложенной модели второго типа было проведено компьютерное моделирование процессов облучения клеток F. tularensis динамическими спекл-полями. Для характеристики степени поражения мембраны бактерий туляремии в результате ФДВ использовали характерику Lesion 1.

Времення динамика этой величины продемонстрирована на рисунке 54.

Точками представлены результаты моделирования с использованием соотношения (23). Сплошная кривая – решение, полученное в отсутствие динамических спеклполей (случай освещения бактериальной взвеси светом с постоянной интенсивностью). Эта кривая описывается математическим выражением (22). Видно, что именно динамика спеклов, а не статическое поле, играет определяющую роль в инактивации клеток. С течением времени (в данном эксперименте после 10 с облучения) степень поражения клеток стремится к некоторому стационарному уровню (Lesion = 1), соответствующему полной инактивации клеток (Рисунок 55), хотя при этом остаются значительные флуктуации этой величины за счет восстановительных процессов в клетке.

Рисунок 54 –Влияние условий ФДВ на жизнеспособность бактерий F. tularensis 15:

Рисунок 55 – Влияние условий ФДВ на жизнеспособность бактерий F. tularensis 15:

На рисунке 56 представлены плотности распределения вероятности степени инактивации. Видно, что при увеличении времени облучения максимум распределения смещается в окрестность значения Lesion = 1, что соответствует инактивации всех клеток данной взвеси (Рисунок 56 а–в). При выбранном режиме Рисунок 56 – Плотность распределения вероятности степени инактивации клеток F. tularensis 15 в процессе ФДВ: а – 0,3 с, I = 1 мВт/см2, С = 0,005 %; б – 3 с, I = 1 мВт/см2, С = 0,005 %; в – 30 с, I = 1 мВт/см2, С = 0,005 %; г – 300 с, (I = 1 мВт/см2, С = 0,005 %) гарантированная инактивация 99 % бактерий F. tularensis 15 происходит на 6 мин облучения (Рисунок 56 г).

На рисунке 57 а, б представлена динамика процессов инактивации клеток при облучении флуктуирующим спекл-полем при различных значениях средней мощности и концентрации фотосенсибилизатора.

Рисунок 57 – Динамика инактивации клеток F. tularensis 15 в процессе ФДВ, Очевидно, что чем выше значение параметра C Po, тем выше концентрация О2* во взвеси и, как результат, тем быстрее происходит инактивация бактериальных клеток.

Интересно отметить, что в начальный период облучения степень инактивации клеток практически не коррелирует с флуктуациями интенсивности спекл-поля (Рисунок 58 а). По истечении некоторого времени, когда система переходит в квазистационарный режим, наблюдается явно выраженная и детерминированная взаимосвязь между упомянутыми характеристиками (Рисунок 58 б).

Для идентификации параметров модели была проведена серия опытов in vitro.

При облучении взвеси бактерий F. tularensis 15 каждый из параметров варьировали в облучения менялось от 3 до 210 мин). С использованием методов регрессионного анализа и методов нелинейной оптимизации были определены первые в представлении (22). Ошибка интерпретации данных при этом коэффициентов не превышала 20% (Таблица 11).

Как показали результаты компьютерного моделирования, инактивация практически всех клеток (более 99 %) F. tularensis 15 происходила после 5 мин облучения при I = 1 мВт/см2 в присутствии МС малой концентрации, С = 0,005 %.

Теоретические результаты хорошо соответствовали данным компьютерного эксперимента. Для подтверждения функциональности математической модели необходимо было проведение эксперимента in vitro с бактериями F. tularensis 15.

Действительно, анализ действия красного светодиодного излучения на взвесь клеток вакцинного штамма F. tularensis 15 выявил снижение числа КОЕ под действием ФДВ (I = 1 мВт/см2) с 0,005 % МС (Рисунок 59). Рост клеток подавляло облученеи в течение 15 мин – 86 ± 4 %; 40 мин – 64 ± 2 %; 240 мин – 8 ± 0,1 % и далее вплоть до полного отсутствия роста бактерий через 6 ч облучения (Рисунок 60).

Рисунок 58 – Динамика инактивации клеток F. tularensis 15 под ФДВ, Р = 0,2 мВт;

С = 0,005 %: а - в первые 5 с; б - после 80 с облучения ( P(t ) S I (t ) – мгновенная мощность излучения; S – площадь облучаемой взвеси) Таблица 11 – Идентификация параметров взаимодействия бактерий F. tularensis с красным светодиодным излучением (нелинейная модель) F. tularensis Для определения жизнеспособности бактерий F. tularensis 15 после ФДВ, взвесь клеток высевали на плотную питательную среду FT-агара и культивировали в течение 10 суток при температуре 37 оС. Клетки вакцинного штамма F. tularensis 15, утратившие способность к размножению после 6 ч ФДВ, были несколько увеличены в размерах по сравнению с интактными бактериями (Таблица 12).

Отношение их к окраске по Граму не изменилось. Так же как и интактные бактерии, они плохо воспринимали краситель и были окрашены в бледно розовый цвет.

Для выявления специфического О-антигена у бактерий F. tularensis 15 до и после фотодинамического воздействия ставили РА с туляремийной агглютинирующей сывороткой согласно инструкции (Инструкция по применению … Иркутск, 2006). В пробирках, содержащих интактную взвесь бактерий вакцинного штамма F. tularensis 15, отмечали агглютинат, выстилающий дно пробирок в виде «зонтика», до разведения сыворотки 1:3200, надосадочная жидкость была прозрачной – реакция положительная на 4 +. В опытном ряду пробирок, содержащих взвесь после ФДВ регистрировали агглютинат до разведения сыворотки 1:1600 и опалесцирующую надосадочную жидкость – реакция положительная на 3 +. Таким образом РА в.

Рисунок 59 – Изменение числа КОЕ бактерий F. tularensis 15 НИИЭГ после ФДВ (I = 1 мВт/см2; МС = 0,005 %) в течение 5–360 мин; Кк – контроль культуры; Кмс – контроль культуры с МС; Ксд – контроль облучения Рисунок 60 – Изменение числа КОЕ бактерий F. tularensis 15 НИИЭГ после Таблица 12 - Размеры клеток штамма F. tularensis 15 НИИЭГ до и после ФДВ Штамм бактерий контрольном и опытном рядах пробирок проходила до титра сыворотки, что свидетельствовало о сохранении О-антигена бактерий F. tularensis 15.

Для подтверждения сохранения активности диагностически значимых антигенов бактерий вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ также проводили постановку РНГА с указанной культурой, интактной и после инактивации, методом ФДВ в течение 6 ч. При учете результатов РНГА в лунках, содержащих как интактные, так и фотоинактивированные бактерии, отмечали положительную реакцию на 4 + (7,5·106 м.к./мл) (Рисунок 61). Изменений антигенной активности в реакции с контрольными и облученными бактериями не зафиксировано.

Рисунок 61 – Результаты РНГА с коммерческим иммуноглобулиновым туляремийным диагностикумом: I – интактная взвесь F. tularensis 15 НИИЭГ, II – взвесь F. tularensis 15 НИИЭГ после ФДВ в течение 6 ч Полученный положительный результат РНГА с культурой бактерий вакцинного штамма F. tularensis 15, обработанной методом ФДВ в течение 6 ч, свидетельствует о сохранении антигенной структуры.

Таким образом, культура вакцинного штамма F. tularensis 15 после инактивации методом ФДВ (I = 1 мВт/см2; МС = 0,005 %) в течение 6 ч полностью утрачивает колониеобразующую способность, сохраняя при этом комплекс специфических антигенов, определяемых коммерческими тест-системами.

4.3. Характеристика культурально-морфологических, биохимических и серологических свойств бактерий вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ Дальнейшие исследования по инактивации бактерий методом ФДВ проводили, используя клетки вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ. Эти бактерии представляли собой мелкие, прямые, с закругленными концами, неподвижные, грамотрицательные, биполярные палочки размерами 0,5х3 мкм (Рисунок 62 а). На HIB агаре они формировали характерные колонии R-типа диаметром до 3 мм серовато-белого цвета, прозрачные с выпуклым центром (Рисунок 62 в). При микроскопии был виден мелкозернистый центр, плоские и волнистые края. Старые колонии становились грубыми, темными, менее прозрачными, с более плотным и бугристым центром, диаметр которого увеличивался, а периферическая кружевная зона уменьшалась. При температуре 37 оС вырастали маслянистые колонии, которые легко суспендировались. В бульоне бактерии Y. pestis EV образовывали осадок в виде комочка ваты, на поверхности нежную пленку, столбик жидкости оставался прозрачным (Рисунок 62 б). Изучение биохимической активности показало, что используемый в экспериментах штамм обладал типичными свойствами: микробы штамма EV ферментировали с образованием кислоты без газа глюкозу, галактозу, арабинозу, ксилозу, маннит, Рисунок 62 – Изучение типичных культурально-морфологических свойств штамма Y. pestis EV НИИЭГ: а – морфология и размеры клеток (отрезок соответствует 5 нм), б – рост культуры в HIB бульоне, в – рост культуры на HIB агаре, г-микроскопия мальтозу и рамнозу; не ферментировали мочевину, сахарозу, лактозу. Эти бактерии обладали положительной пестин-фибринолизин-плазмокоагулазной активностью.

Культура лизировалась чумным диагностическим фагом Л-413 С (Таблица 13).