Ульянова онега владимировна методология повышения безопасности бактериальных вакцин на модели вакцинных штаммов brucella abortus 19 ba, francisella tularensis 15 нииэг, yersinia

Общеизвестна потребность прокариот, в том числе и штаммов чумного микроба в ионах кальция, проявляющуюся при температуре 37 С (Higuchi at al., 1959;

Домарадский, 1993). Вероятно, при ФДВ на клетки вакцинного штамма чумного микроба, происходит не только активация ПОЛ, вызывающая нарушение структуры клеточных мембран, но и активация АО сиситемы, а также стимуляция роста клеток ионами Ca2 +. В перспективе изучение упомянутых процессов, представляет интерес.

В гемагглютинационном тесте по выявлению капсульного антигена в бактериальных взвесях вакцинного штамма Y. pestis EV до и после обработки методом ФДВ отмечалась положительная реакция.

Полная потеря жизнеспособности клеток вакцинных штаммов B. abortus 19 BA происходит после 180 мин и F. tularensis 15 НИИЭГ - 360 мин ФДВ. С помощью электронной микроскопии инактивированных бактерий B. abortus 19 ВА и F. tularensis 15 НИИЭГ выявлено незначительное увеличение размеров клеток, тинкториальные свойства не изменились. В реакциях агглютинации и непрямой гемагглютинации выявлено сохранение у бактерий B. abortus 19 ВА и F. tularensis НИИЭГ после ФДВ активности диагностически значимых антигенов.

Исследования 5 главы посвящены оценке безвредность, остаточной вирулентности и реактогенности вакцинных штаммов B. abortus 19 BA и F. tularensis 15 НИИЭГ до и после ФДВ на морских свинках регламентированными методами, а также когерентно-оптическими, с использованием разработанных установок, включающих биосистемы «бактерии-макроорганизм».

Установлено, что температура тела и масса животных после введения фотоинактивированных взвесей бактерий вакцинных штаммов бруцеллеза или туляремии были в пределах нормы, не отмечено гибели животных; при вскрытии изменений внутренних органов и тканей не выявлено, рост исследуемых бактерий на питательных средах в мазках отпечатках из органов отсутсвовал.

Оценку реактогенности вакцинных штаммов B. abortus 19 BA и F. tularensis НИИЭГ до и после ФДВ проводили на морских свинках на тканевом и организменном уровнях методами спекл-микроскопии и спекл-имиджинга. В предварительных экспериментах была доказана неинвазивность использованных когерентно-оптических методов.

Методом спекл-микроскопии показано, что аппликация бактерий F. tularensis НИИЭГ после ФДВ на брыжейку морской свинки приводила к расширению стенок сосуда и замедлению кровотока в 16 раз, восстановление кровотока регистрировали через 5 мин. Нанесение взвеси клеток B. abortus 19 ВА после ФДВ вызывало сужение микрососудов и пятикратное увеличение скорости кровотока; через 10 мин кровоток полностью восстанавливался.

Методом спекл-имиджинга установлено, что изменений топологии цебральных сосудов в течение 40 мин после введения указанных бактерий не зарегистрировано.

Таким образом, разработаны фундаментальные основы новой методологии повышения безопасности вакцинных штаммов B. abortus 19 BA, F. tularensis НИИЭГ, включающие фотодинамическую инактивацию бактерий, создание математической модели условий воздействия для каждого штамма и оценку их безопасности.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны фундаментальные основы новой методологии повышения безопасности вакцинных штаммов B. abortus 19 BA, F. tularensis 15 НИИЭГ, включающей фотодинамическую инактивацию бактерий, создание математических моделей, оптимизацию условий воздействия для каждого штамма и методику оценки их безопасности.

2. Создана компактная лабораторная установка для инактивации бактерий методом фотодинамического воздействия, позволяющая изменять условия фотосенсибилизатора, источники излучения, плотность мощности излучения;

длительность проведения фотодинамического воздействия для конкретных вакцинных штаммов; получать за один сеанс облучения в стерильных условиях бокса биологической безопасности препаративное количество (38,4 мл) бактериальной взвеси для дальнейших микробиологических, серологических и биологических исследований.

3. Экспериментально показана возможность проведения фотодинамической инактивации взвесей бактерий E. coli разных штаммов, P. aeruginosa 27533, B. abortus 19 BA, F. tularensis 15 НИИЭГ и Y. pestis EV НИИЭГ на созданной лабораторной установке. Установлено влияние на колониеобразующую способность разных штаммов бактерий E. coli и P. aeruginosa, вакцинных штаммов B. abortus BA, F. tularensis 15 НИИЭГ и Y. pestis EV НИИЭГ совокупности факторов:

концентрации бактериальной взвеси, количества фотосенсибилизатора, плотности мощности излучения и времени фотодинамического воздействия.

4. Доказано, что эффективная инактивация происходит при обработке бактериальных взвесей в концентрации 1·109 м.к./мл излучением световых диодов с длиной волны = 650 ± 10 нм, плотностью мощности излучения 1 мВт/см 2 и концентрацией фотосенсибилизатора метиленового синего 0,005 %. Доказана полная потеря жизнеспособности клеток E. coli В6, E. coli О1, E. coli К12 при фотодинамическом воздействии в течение 60 мин, вакцинных штаммов B. abortus BA - 180 мин и F. tularensis 15 НИИЭГ - 360 мин; при сохранении морфологических и тинкториальных свойств бактерий вакцинных штаммов B. abortus 19 BA и F. tularensis 15 НИИЭГ и комплекса их антигенов, определяемых коммерческими диагностическими препаратами.

5. Впервые определен размер области эффективного воздействия синглетного кислорода на клеточную мембрану бактерий с использованием компьютерного моделирования на основе разработанной теоретико-вероятностной модели воздействия синглетного кислорода на бактериальные клетки.

6. Разработаны математические модели взаимодействия бактериальных взвесей разных штаммов E. coli, P. aeruginosa, вакцинных штаммов B. abortus 19 BA, F. tularensis 15 НИИЭГ и Y. pestis EV НИИЭГ с оптическим излучением, проведена идентификация параметров предложенных моделей. В результате оптимизации определены наиболее эффективные условий фотодинамической инактивации.

Проведена верификация найденных условий в in vitro эксперименте.

7. Экспериментально доказаны безвредность, отсутствие остаточной вирулентности и снижение реактогенности вакцинных штаммов B. abortus 19 BA и F. tularensis 15 НИИЭГ после фотодинамической инактивации на морских свинках методами прижизненных наблюдений, а также по макроскопическим морфологическим показателям: температура и масса тела были в пределах нормы, гибели животных не отмечено; при вскрытии не выявлено изменений внутренних органов и тканей, отсутствие роста исследуемых бактерий в мазках отпечатках из органов.

8. Впервые на морских свинках проведена оценка реактогенности на тканевом и организменном уровнях вакцинных штаммов B. abortus 19 BA и F. tularensis разработанных установок, включающих биосистемы «бактерии-макроорганизм» и регистрации результатов методами спекл-микроскопии и спекл-имиджинга; доказана неинвазивность использованных когерентно-оптических методов.

9. Показано, что взвеси бактерий после фотодинамической инактивации вызывают выраженные, но обратимые изменения скорости кровотока в брыжеечных сосудах морской свинки: аппликация клеток F. tularensis 15 НИИЭГ приводила к расширению стенок сосуда и замедлению кровотока в 16 раз, а нанесение клеток B. abortus 19 ВА вызывало сужение микрососудов и пятикратное увеличение скорости кровотока. Восстановление нормального кровотока зарегистрировано через 5-10 мин. Изменений топологии церебральных сосудов в течение 40 мин после внутримышечного введения указанных бактерий не зарегистрировано.

I – плотность мощности излучения Р – мощность излучения – длина волны АО – антиоксидантная система ЖВ – живая вакцина КОЕ – колониеобразующие единицы ЛД – лазерные диоды ЛИ – лазерное излучение м.к. – микробные клетки МП – микропланшет МС – метиленовый синий НИЛИ – низкоинтенсивное лазерное излучение НКС – нормальная кроличья сыворотка ПОЛ – перекисное окисление липидов РА – реакция агглютинации РНГА – реакция непрямой гемагглютинации С – концентрация метиленового синего СД – световые диоды УФИ – ультрафиолетовое излучение УФО – ультрафиолетовое облучение ФДВ – фотодинамическое воздействие

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абортогенные и антигенные свойства антибиотикорезистентных вариантов штамма В. abortus 82 / A. M. Фомин [и др.] // Ветеринарный врач. – 2006. – № 1. – С. 18–20.

2. Авилов, В. М. Бруцеллез животных и его специфическая профилактика / В. М.

Авилов, В. В. Селиверстов // Ветеринария. – 1997. – № 7. – С. 3–13.

3. Авилов, В. М. Эпизоотологический надзор при бруцеллезе крупного рогатого скота в современных условиях : автореф. дис. … д-а вет. наук / В. М. Авилов. – СПб., 1977. – 49 с.

4. Ада, Г. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ / Г. Ада, А. Рамсей. – М. :

Медицина, 2002. – 344 с.

5. Аденозин трифосфатная активность эритроцитарных мембран крыс во время применения низко-интенсивных лазеров / Е. Н. Панасюк [и др.] // Вопросы курортологии физиотерапии лечения физической культуры. – 1987. – № 2. – 6. Аналитическая справка по инфекционной заболеваемости в государствахучастниках СНГ за 2010 г. – Режим доступа : http://www.microbe.ru/kspp/analitic2.

7. Анисимов А. П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1 / А. П. Анисимов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2002. – № 3. – С. 8–23.

8. Анисимов, А. П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 2 / А. П. Анисимов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2002. – № 4. – С. 3–11.

9. Антибактериальная фотодинамическая терапия при хроническом тонзиллите у детей / С. А. Наумов [и др.]. – Режим доступа : http://altermed.com.ua/lib_156html.

10.Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности. СП 1.2.011-94. Санитарные правила. – М., 1994.

11.Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности и гельминтами. СП 1.2.731-99. Санитарные правила. – М., 1999.

12.Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Санитарноэпидемиологические правила СП 1.3.2322-08. – Режим доступа :

http://www.opengost.ru.

13.Бендат, Дж. Прикладной анализ случайных данных / Дж. Бендат, А. Пирсол. – М. : Мир, 1989. – 540 с.

14.Биотехнология / под ред. А. А. Баева. – М., 1984. – 376 с.

15.Большой энциклопедический словарь. Биология / Гл. ред. М. С. Гиляров. – М. :

Большая российская энциклопедия, 1999. – 864 с.

16.Брайцев, A. B. Лечение больных с ограниченными формами нейродермита и экземы ионофорозом метиленового синего / А. В. Брайцев, В. М. Желтаков // Вестник дерматологии и венерологии. – 1973. – № 7. – С. 73–76.

17.Бриль, Г. Е. Модификация лазерным излучением лимфоконстрикторного действия стафилококкового токсина / Г. Е. Бриль, Е. И. Захарова (Галанжа) // Лазерная техника и оптоэлектроника. – 1992. – № 1–2. – С. 36–39.

18.Бруцеллез / П. Н. Жованик [и др.]. – Киев : Ураджай, 1975. – 221 с.

19.Бруцеллез : метод. рекомендации по диагностике, лечению и реабилитации больных. – М., 1987. – 28 с.

20.Буткин, Е. И. Бруцеллез // Эпизоотология с микробиологией / Е. И. Буткин ;

под ред. И. А. Бакулова. – М. : Колос, 1981. – С. 145–152.

21.Вакцины и вакцинация : национальное руководство / под ред. В. В. Зверева, Б. Ф. Семенова, Р. М. Хаитова. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 880 с.